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关键词 ES细胞 拟胚体 神经分化 无血清悬浮培养 皮层神经元

Directed differentiation of telencephalic cautical neurons

from mouse embryonic stem cells by embryoid body

Abstract

Objective

Method

Result

Conclusions

Key words ES cells; Embryoid body; Neural differentiation; Serum-free suspention culture; cautical neurons

前言

在胚胎发生期间，端脑原基被细分为Pax6+背侧区域(皮层，可形成皮质，皮质皱褶和脉络丛)和Pax6-腹侧区域(皮下层，可形成基底核)。(Guillemot，2005;Puelles et al.，2000;Rallu et al.，2002)

最近，我们研发了一种高效的神经诱导方法，利用无血清悬浮培养技术诱导小鼠ES细胞(mESCs)向神经中枢选择分化。该法可使ES细胞自主发生神经分化，无需外部诱因。重要的是，此种诱导技术能使mESC高频分化为Bf1(FoxG1)+端脑前体细胞，其中大部分细胞表达皮质标记物Pax6，而Shh处理抑制Pax6表达，且诱导皮下层标记物表达，诸如Nkx2.1。

本文首先介绍一种改良的三维聚集培养法，此法可高效诱导ESC分化为皮质前体细胞和有功能的投射神经元。www.51lunwen.com/yxlwgs/ Then, 医学论文格式范例using this ESC culture, we demonstrate the in vitro recapitulation of embryonic corticogenesis and its manipulation with respect to layer-specific neurogenesis and regional specification. 最后，我们验证了该法诱导的皮质前体细胞可自发形成分层结构，模拟了皮质发生的早期阶段。我们讨论了源自ESC的皮质神经上皮其自发形成组织的惊人能力。

1材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

BALB/C孕母鼠一只，复旦大学医学院动物房提供

超净工作台 华山医院神经外科实验室

Nicon显微镜

一抗：

二抗：

流式分选抗体：

1.2小鼠ES细胞的培养

小鼠ES细胞在预先0.1%明胶(Sigma)包被的培养皿上培养， 置于 37℃, 5%的 CO 2 细胞培养箱。其培养基成分为G-MEM (Gibco)中添加 1% FBS (Gibco)、10%KSR (Gibco)、2 mM 谷氨酰胺 (Gibco)、0.1 mM 非必需氨基酸(Gibco)、1 mM 丙酮酸盐、0.1 mM2-巯基乙醇 (Gibco)和 2000 U/mL LIF (Gibco)[1]。ES细胞每隔 3d传代 1 次, 传代时用 0.05% 胰酶 (Gibco) 37℃消化 5 min. 细胞按照1:2~1:4的比例进行传代.

1.3 小鼠ES细胞的鉴定

免疫荧光

1.4小鼠ES 细胞向脑皮层神经元的定向分化

分化液成分为G-MEM (Gibco)中添加10%KSR (Gibco)、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸盐、0.1 mM 非必需氨基酸(Gibco)、0.1 mM2-巯基乙醇 (2-ME)，250 ng/ml 重组人Dkk-1，和 1 mg/ml重组人Lefty-1(which can be replaced by 10 mM SB431542)。

SFEB法进行神经诱导时，用0.05%胰酶-EDTA 将ES细胞消化为单个细胞，以5×104个/ml细胞密度接种在10ml明胶包被培养皿上。细胞1天内凝结成团。接种ES细胞到分化液中的这天定义为第0天。

第3天 换液。

第5天 以1-2×102团/cm2细胞密度接种在另包被培养皿上(多聚赖氨酸，层粘连蛋白，纤维结合蛋白)。

第7天 更换另一种分化液。分化液成分为G-MEM (Gibco)中添加N2、2 mM 谷氨酰胺 (Gibco)、0.1 mM 非必需氨基酸(Gibco)、1 mM 丙酮酸盐、0.1 mM2-巯基乙醇 (2-ME)。

重组人BMP-4蛋白、人Dkk-1蛋白、人Lefty-A蛋白、小鼠Nodal蛋白、小鼠Shh-N 肽(25–198) 和小鼠Wnt-3A蛋白(R&D Systems)，以上这些因子每次换液时，另加入培养液中。

1.5脑皮层神经元的鉴定

免疫荧光，流式分选

2 结果

讨论

结论

参考文献

[1] Eiraku M., Watanabe K., Matsuo-Takasaki M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation www.51lunwen.com/yxlwgs/ by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell, 2008, 3(5): 519-532.

[2] Gaspard N., Bouschet T., Hourez R., et al. ,An intrinsic mechanism of corticogenesis from embryonic stem cells. Nature, 2008, 455(7211):351-U10

综述

参考文献

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