摘要:　目的研究淡竹叶清热作用有效部位及化学成分，为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的制定提供科学依据。方法采用体外抑菌实验筛选淡竹叶有效抑菌部位，并采用HPLC-MS法分析抑菌部位的化学成分。结果淡竹叶甲醇提取部位具有抑菌作用，根据液质联用图谱及文献，分析鉴定出淡竹叶甲醇提取部位中6个化学成分，分别为香草酸、香豆酸、牡荆苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黄酮、芦竹素或其同分异构体白茅素及苜蓿素。结论淡竹叶甲醇提取部位具有一定的抗菌活性，对各菌种的抑菌效果有较大差异，这一部位可能与淡竹叶清热解毒功效相关。采用HPLC-MS法分析鉴定有效部位化学成分，保留了液相色谱与质谱兼具的微量、快速的优点,结合了前者的高分离效能与后者的准确性及选择性的特点,方法稳定可靠，为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的完善提供科学依据。

关键词:  中药鉴定 淡竹叶 抑菌实验 液质联用

淡竹叶为禾本科植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn. 的干燥茎叶［1］。始载于《本草纲目》，1977年以来的历版《中国药典》均有收载，具有清热除烦、利尿的功效。用于热病烦渴，小便赤涩、淋痛，口舌生疮。淡竹叶为卫生部公布的药食两用中药之一，近年来多有制成保健凉茶［2］、淡竹叶酸奶［3］等。

淡竹叶的有效成分物质基础研究一直较为薄弱，现有化学成分的研究显示淡竹叶主含黄酮、三萜类、多糖、酚性成分、氨基酸、有机酸及多种微量元素等［4～6］。依据现代医学理论，结合淡竹叶的中医临床功效，本实验对淡竹叶不同溶剂的提取部位进行了抑菌活性的研究，对淡竹叶清热有效物质基础进行初步筛选，并运用液质联用分析手段对所筛选的部位进行化学成分分析，为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的制定提供科学依据。

1   仪器与材料

1.1   仪器手提式压力蒸气灭菌器（上海华线医用核子仪器有限公司）；移液枪（北京金花移液器厂）；HPLC－MS/MS液质联用仪（Water's公司，型号Quattro Primer，产地：美国）。

1.2   菌株

大肠杆菌 CMCC(B) 44103；金葡菌CMCC(B)26003；乙链菌CMCC（B）32210；绿脓菌CMCC(B)24430。

1.3   药物营养琼脂（国药集团化学试剂有限公司，批号F20040304）；肉汤培养基（国药集团化学试剂有限公司，批号20060310）；血琼脂基础（国药集团化学试剂有限公司，批号20060228）；葡萄糖肉汤（国药集团化学试剂有限公司，批号10010518）；香草酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110776－200402）。牡荆苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号11876－200501）。淡竹叶采于江苏省宝华山，经南京中医药大学鉴定教研室吴启南教授鉴定为禾本科(Gramineae)植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.的干燥茎叶。

2    方法与结果

2.1   不同提取部位抑菌实验

2.1.1   提取部位制备

淡竹叶置于多功能提取罐，60％乙醇回流提取5 h，提取液减压回收溶剂得到淡竹叶总浸膏，总浸膏与硅藻土拌匀，分别加入石油醚、二氯甲烷、甲醇、水逐级超声提取，减压回收溶剂，得石油醚提取部位、二氯甲烷提取部位、甲醇提取部位和水提取部位，作为供试品。

2.1.2  不同提取部位抑菌实验取上述供试品各1 g，加入蒸馏水1 ml，超声溶解。在超净工作台上将灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中，待冷却凝固后，用无菌移液管吸取1∶1 000稀释的大肠、金葡、绿脓菌液加到平皿上，用刮铲将菌液涂匀，再用打孔器在培养基上打孔，打孔后每个孔内注入25 μl药液，37℃培养24 h，观察实验结果。结果见表1。表1  淡竹叶不同提取部位抑菌实验结果（略）

从药敏实验中发现，淡竹叶的石油醚、二氯甲烷及水提取部位对该3种细菌抑菌效果为阴性，甲醇提取部位对该3种细菌抑菌效果为阳性，故对甲醇提取部位的抑菌效果做进一步的实验。

2.2  甲醇提取部位抑菌实验

2.2.1  对金葡菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的抑菌实验将甲醇提取部位的浸膏配成相当于生药浓度为40，20，10，5，2.5，1.25，0.625 g·ml-1。同“2.1”项下方法实验，制作培养基，将菌液涂匀于培养基上，打孔，分别注入20 μl的药液，37℃培养，24 h后观察抑菌结果。结果见表2。表2  不同浓度甲醇提取部位对3菌种抑菌圈直径平均值（略）

从表2中我们可以看出淡竹叶甲醇提取部位对金葡菌、绿脓杆菌和大肠杆菌均有一定的抑菌效果，抑菌效果依次为：绿脓杆菌>金葡菌>大肠杆菌，但都属于低敏的范围。

2.2.2  甲醇提取部位对乙链球菌的抑菌实验将提取部位按照浓度为10，5，2.5，1.25，0.625 g·ml-1制作血平板，加入乙链球菌，放入37℃温箱培养24 h，次日观察实验结果。

结果显示，5 g·ml-1以下均有乙链球菌生长，故淡竹叶甲醇提取部位对乙链的抑菌最小浓度为10 g·L-1。

2.3  淡竹叶甲醇提取部位化学成分液质联用分析

2.3.1    供试品制备取浙江产淡竹叶20 g，氯仿回流提取脂溶性物质至无色，药渣再用甲醇回流提取至无色，溶液蒸干热水溶解，离心，上清液过大孔树脂，弃去水液与20％乙醇液，收集75％乙醇溶液，减压回收溶剂至干，甲醇定容于5 ml容量瓶中，作为供试品溶液。

2.3.2    分析条件色谱条件：色谱柱为 C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）；流动相为A（乙腈），B（水，0.05%甲酸）；梯度：0→15 min，A：5%→70%；B：95%→30%；流量0.5 ml·min-1；进样量2μl；柱温40℃；柱后分流后进入质谱仪。
质谱条件：电离源为ESI+；检测方式为正离子模式；毛细管电压为3.0 kV；锥孔电压为30 V；离子源温度为120℃；扫描范围为m/z 150～600；氮气流量为400 L·h-1。

2.3.3   样品分析将供试品溶液分别放入自动进样器中，按选定的测试条件，进行检测，得供试品的总离子流色谱图，结果见图1。

2.3.4  总离子流色谱图中化合物的鉴定根据MS所测定的［M+H］+ 值及质谱图谱，通过检索文献［4～6］及部分标准品对照，鉴定出6个化合物，分别为香草酸、香豆酸、牡荆苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黄酮、芦竹素和苜蓿素。结果见表3。表3  甲醇提取部位中化学成分鉴定结果（略）

3  讨论

淡竹叶抑菌实验结果表明，甲醇提取部位对大肠杆菌、金葡菌、绿脓杆菌均有一定的抑菌作用，其中对绿脓杆菌的作用较强，对大肠杆菌的作用较弱；对乙链球菌也有一定的抑菌作用，其最小抑菌浓度为10g·ml-1。淡竹叶具有一定抑菌作用，但抑菌作用不强，根据这一结果，分析淡竹叶的临床清热作用，可能存在其它的作用机制，如增强免疫功能等。

本文首次运用HPLC-MS法对淡竹叶中有效抑菌部位（甲醇提取部位）的化学成分进行了深入分析研究，根据质谱图谱，参考现有淡竹叶化学成分研究的文献，并部分采用标准品对照等方法，初步鉴定出甲醇提取部位中的6个化学成分分别是香草酸、香豆酸、牡荆苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黄酮、芦竹素和苜蓿素。现有研究结果表明，香草酸、香豆酸具有抗菌消炎作用，牡荆苷具有抗炎解痉与降压活性，对大肠杆菌有抑制作用。从总离子流色谱图中可以看出，淡竹叶甲醇提取部位中所含的成分十分复杂，由于淡竹叶化学成分的基础研究薄弱，一些量大的化合物如相对保留时间为tR0.95 min，tR4.15 min，tR4.65 min，tR6.81 min等色谱峰还未能鉴定，有待进一步研究。

本文研究结果初步确立了淡竹叶中清热解毒成分，主要是有机酸、黄酮和三萜类化合物，为淡竹叶质量标准的完善和提高奠定了实验基础。

【参考文献】

［1］国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］ ．北京：化学工业出版社，2005：230.

［2］靳桂敏，廖文通．苦瓜、金银花、淡竹叶复合保健饮料的研制［J］ ．现代食品科技，2006，23（2）：37.

［3］马亚宁, 吕嘉枥, 李娟萍．淡竹叶酸奶的研制［J］ ．食品研究与开发，2007，128（3）：96.

［4］陈 泉, 吴立军，王 军，等．中药淡竹叶的化学成分研究［J］．沈阳药科大学学报，2002,19 (1)：23.

［5］陈 泉， 吴立军，阮丽军．中药淡竹叶的化学成分研究( II)［J］．沈阳药科大学学报，2002,19 (4)：257.

［6］中国医学科学院药物研究所．中草药有效成分的研究［M］．北京：人民卫生出版社，1972：441.