摘要：目的研究荨麻提取物中水溶性成分的5a-还原酶抑制活性。方法基于荧光测定的方法，建立一种5a-还原酶抑制剂体外模型，从大鼠前列腺组织中提取5α-还原粗酶,与底物睾酮（Testosterone）以及供氢体还原型辅酶Ⅱ（NADPH）共同组成了一种微量反应体系。利用荧光测定仪检测NADPH的含量，以荧光的强弱来判断5a-还原酶的活性，以非那雄胺作为阳性对照。结果同对照组相比，反应体系中加入荨麻提取物后荧光值有显著升高。结论荨麻根的水溶性成分在体外能够抑制5a-还原酶的活性。

关键词：  5α-还原酶 荨麻 双氢睾酮 前列腺增生

良性前列腺增生症(BPH) 是中老年男性常见病与多发病，发病率在40 岁时约为23%， 至90 岁时可达88%。在寻找其治疗药物过程中，甾体5α- 还原酶抑制剂已成为研究热点之一［1］。从构效关系看，5α-还原酶是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白,依赖还原型辅酶II(NADPH) 作为供氢体，该酶广泛存在于前列腺及其它组织和器官中，是睾酮转变为双氢睾酮的催化剂［2］，它不可逆地催化睾丸酮 (T)转为生理活性更强的双氢睾丸酮 (DHT)，DHT被认为是良性前列腺增生症(BPH)的主要病因, 抑制该酶活性, 减少DHT生成，已经成为BPH 非手术治疗的主要途径［3］。

我们前期的药理实验表明，荨麻根的提取物对去势大鼠前列腺腹侧叶和背侧叶的增生具有显著的抑制作用［4］。为了进一步研究提取物抗前列腺增生的作用机理，本实验选取5α-还原酶为作用靶点，利用荧光测定的方法，研究荨麻提取物是否有抑制5α-还原酶的活性。

首先建立酶催化反应体系，利用辅酶NADPH具有自发荧光特性（NADPH本身有强烈荧光，当NADPH与还原酶和底物反应后，NADPH生成NADP+, 荧光随之淬灭）通过荧光检测仪测定NADPH的含量来考察5α-还原酶的活性［5］。

1  材料与仪器

1.1  药品与试剂非那雄胺(保列治), Merck Sharp & Dohme (U.K.)Ltd。批号J20050041；睾酮，上海久邦化工公司产品，批号20051106；NADPH，Biosharp公司产品， 批号041939；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2  仪器荧光检测仪 （型号：FP-6500，Jasco公司）；台式高速冷冻离心机（型号: Biofuge prime， R Heraeus公司） ；ALPHA1-4型冷冻干燥机（CHRIST公司）；数显恒温水浴锅（型号：HH-2，常州国华电器公司）。

2  方法

2.1  还原酶的制备［6］雄性SD大鼠3只［体重(200 g±10)g 大连医科大学实验动物中心提供］，禁食不禁水过夜后处死，迅速取腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(蔗糖0.73 mol/L，氯化钙1.91 mmol/L)在玻璃匀浆器中匀浆［7］，在4℃下以10 000 r/min高速离心20 min，取上清液再以16 000 r/min低温高速离心30 min，即为5α-还原酶提取物，采用Lowry法测定蛋白含量，以酶提取物中的总蛋白含量表示5α-还原酶提取物的含量，将提取物放入小离心管在-70℃下保存，临用前取出。

2.2  5α-还原酶活性测定和反应条件优化取5.0 ml的小试管，将底物、酶提取液,辅酶等反应成分依次加入，然后加入缓冲液（PBS 2.0 mmol/L, 蔗糖 0.2 mol/L, EDTANa2 1.0 mmol/L, pH 6.8）至2 ml，在37℃下反应1 h。然后用荧光检测仪测定反应体系的荧光值。为了获得最佳酶活性测定反应参数，对反应温度、底物、酶的浓度以及反应时间的反应条件进行优化，同时以特异性5α-还原酶抑制剂非那雄胺［8,9］作为阳性对照。

2.3  荨麻提取物的制备和活性研究取荨麻根50 g，粉碎成1 cm的小段，室温下用水浸泡12 h，将提取液过滤浓缩后，加乙醇至浓度达到80％（去除小分子成分，避免荧光干扰），沉淀冷冻干燥后配制成2 mg/ml溶液，按照“2.2”的操作向酶反应体系中加入(最终浓度0.1 mg/ml)，酶促反应后测定其荧光值。

3  结果

3.1  辅酶浓度和荧光测定条件辅酶NADPH浓度为1 mmol/L，荧光仪测定条件：激发波长340 nm；吸收波长461 nm；狭缝宽度3 nm；响应时间 0.5 s。

3.2  睾酮浓度对酶活性的影响在固定酶提物浓度（1.2 mg/ml）和辅酶NADPH的浓度（1 mmol/L）的条件下，逐步增加睾酮浓度，分别是：0.1，0.2，0.5，2.0，20.0 μmol/L和200 μmol/L，在37℃条件下反应1 h，测定荧光值。如图1所示，当底物浓度在0～0.5 μmol/L时，随着睾酮浓度变大，荧光值降低，但当底物浓度增加10倍，100倍时，荧光值不再变化，说明当睾酮浓度到0.5 μmol/L时，即可获得较高的酶活性。

3.3  酶提取物浓度对酶活性的影响确定底物和NADPH浓度以后，考察反应体系所需的酶量，以总蛋白含量表示5α-还原酶提取物含量，用缓冲溶液稀释成一系列浓度，浓度分别为：0.3，0.6，1.2，1.8，2.4 mg/ml，在37℃条件下反应1 h后测定荧光值。如图2所示，随着酶量的增加，荧光值不断降低，当粗酶浓度达到1.2 mg/ml以后，荧光值趋于恒定，因此将反应的酶浓度定为1.2 mg/ml。

3.4  反应温度对酶活性的影响设置不同的温度值，考察对5α-还原酶的影响，温度值分别是：15，25，37，45，60℃。如图3显示，在37℃条件下，相对荧光值最低，说明酶活性最高，当温度升高和降低时，活性有所下降，当温度升高到60℃以上时，荧光值达到较高，基本上已经失去活性，以37℃作为酶反应温度。

3.5  反应时间对酶活性的影响在固定酶的浓度和底物浓度的情况下，测定不同时间点荧光值的变化情况，时间点分别是：5，10，20，30，60，90，120 min。如图4显示，随着反应时间的延长，荧光值逐渐下降，在反应60 min以后，荧光值趋于恒定，说明酶已经反应完全，以60 min作为反应时间。

3.6  阳性对照药对酶活性的影响向反应体系中加入特异性还原非那雄胺，浓度依次为：10，25，50，75，100 μmol/L。结果显示，非那雄胺呈浓度依赖性抑制酶促反应，浓度达到50 μmol/L时，显示较强的抑制作用，表明采用荧光测定建立的5α-还原酶活性测定方法具有专一性。

3.7  荨麻提取物的抑制活性

酶促反应体系加入荨麻提取物(浓度为0.1 mg/ml)，37℃下反应60 min后，测定相对荧光吸收值，结果显示荧光相对值有显著升高，说明荨麻提取物具有5α-还原酶抑制活性，抑制率达到了60.9%。

4  讨论

在研究底物睾酮浓度对酶活性的影响时发现，当反应体系中不加睾酮时，荧光值也有所降低，可能有两个原因，一是大鼠组织液中本身就存在少量睾酮参加了5α-还原酶反应，二是NADPH是一种非特异性的还原型辅酶，它可能作为酶提取物中其它的还原酶的供氢体而在反应中消耗，因此荧光值降低。

文献报道荨麻治疗前列腺增生的作用机理包括抑制芳香酶，抑制Na+-K+-ATP 酶以及与性激素结合球蛋白(SHBG)结合等等，但关于其抑制5α-还原酶活性的报道一直都没有，本研究首次发现荨麻的水溶性成分具有抑制5α-还原酶的活性，至于是哪一个有效部位，多糖，蛋白质抑或其他极性成分还有待于进一步研究。

【参考文献】

［1］欧敏锐,戴小福,薛逢春,等. 高效液相色谱法检测5α-还原酶活性［J］.福州大学学报(自然科学版), 2004, 32(2) : 216.

［2］张 伦. 5α-还原酶抑制剂市场浅析［J］.西部药学，2006, 3(5): 272.

［3］贾 悦,王晓东,崔毓桂,等. 5α-还原酶在男性生殖中的作用［J］.生殖医学杂志，2003,12 (2) :115.

［4］王永奇，冯宝民，李 帆，等.荨麻属植物治疗BPH研究概况［J］.大连大学学报, 2005, 26(2):54.

［5］孙祖越,郑维君,王晓麟,等. 甾体5α-还原酶活性的新测定方法［J］.中华内分泌代谢杂志, 1998,14(3): 206.

［6］王炜,冀保全,唐 玲,等.滇藏荨麻提取物的5α-还原酶抑制活性的研究［J］.时珍国医国药，2008, 19(9):2071.

［7］Fvredrick W.Gveorge. Androgen Metabolism in the Prostateofthe Finasteride Treated, Adult Rat: A Possible Explanation for the Differential Action of Testosterone and 5a-Dihydrotes- tosterone during Development of the Male Urogenita Tract［J］.Endocrinology, 1997，138(3)：871.

［8］崔露阳.良性前列腺增生治疗药物市场扫描［J］.世界临床药物, 2007,28(1): 58.

［9］黄仲义. 良性前列腺增生治疗药物的选择与比较［J］.临床药物治疗杂志, 2007, 5(2): 14.