摘要：目的认识苏木素对胰蛋白酶作用活性的影响及苏木素对胰蛋白酶作用的荧光性质。方法用酶活性法观察苏木素对胰蛋白酶活性的影响；用紫外光谱和荧光光谱研究苏木素对胰蛋白酶作用的光谱性质。结果苏木素对胰蛋白酶活性可产生竞争性抑制，抑制剂常数K1=6.13×10-5 mol/L；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力。结论苏木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所处环境的疏水性增强，使胰蛋白酶分子构象发生变化。

关键词：  苏木素 胰蛋白酶 荧光光谱 紫外光谱 酶活性

中药苏木的主要成分苏木素(Haematorylin)是组织、病理实验室中最常用的染色剂，可用于细胞核染色［1］。苏木素具有收缩血管、中枢抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消肿、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和动物肠道中一种重要的蛋白水解酶，从该酶被发现以来，人们对其进行了一定的研究，如用胰蛋白酶为催化剂对蛋白质进行降解的研究［3～5］。药物对胰蛋白酶作用的性质［6］及苏木素与DNA作用的性质的研究已引起重视［7］。本文主要通过紫外和荧光光谱法研究苏木素与胰蛋白酶作用的性质，从而获得苏木素与胰蛋白酶作用时结构变化、所处微环境等信息，探讨苏木素与胰蛋白酶相互作用的机制，并对苏木素与胰蛋白酶作用活性的影响也进行了研究。

1  器材

1.1  仪器荧光分光光度计，美国Cary Eclipse（瓦里安）产品；双光束紫外可见分光光度计TU－1901，北京普析产品；pH－3C型酸度计，上海精密科学仪器有限公司产品。

1.2  药品牛胰蛋白酶（生化试剂），上海海洋生物技术有限公司产品；苏木素（生物染色剂BS），成都科龙化工试剂厂产品；硼酸（分析纯 ），成都科龙化工试剂厂产品。

2  方法

2.1   苏木素对胰蛋白酶活性影响在恒温水浴箱中将酪蛋白、胰蛋白酶和苏木素预热，按酶活性的测定方法，在胰蛋白酶与酪蛋白的酶解反应体系中加入不同体积的苏木素溶液，测定苏木素对酶活性的影响。胰蛋白酶活性及抑制常数测定参照文献［8］方法操作。

2.2   苏木素对胰蛋白酶紫外光谱的影响配制pH＝7.5的硼酸缓冲溶液（内含0.1 mol/L CaCl2维持离子强度）；用硼酸缓冲溶液配制1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液，再用3次蒸馏水分别配制2.0×10-3mol/L和1.0×10-3mol/L的苏木素溶液。

室温条件下，在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，扫描190～350 nm的吸收光谱。然后用微量注射往其中准确加入1.0×10-3mol/L的苏木素溶液10 μl，混匀，静置2 min后扫描190～350 nm的吸收光谱。扫描1.0×10-3 mol/L苏木素溶液190～350 nm的吸收光谱。

2.3   苏木素对胰蛋白酶荧光光谱影响在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入 1.0×10-4mol/L的胰蛋白酶溶液3.0 ml，用微量注射器分别加入2.0×10-3mol/L的苏木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 μl。每次加入后混匀，放置5 min，分别在20，25，30，35℃下，测定其荧光光谱，激发波长为280 nm，绘制288～450 nm的荧光光谱。

2.4  苏木素对胰蛋白酶作用的同步荧光将“2.3”项下所配的温度为298 K的溶液，固定激发和发射波长间隔△λ分别为20 nm和60 nm，同时扫描激发和发射波长并记录同步荧光光谱。

3  结果

3.1  苏木素对胰蛋白酶活性的影响苏木素对胰蛋白酶有抑制作用，当苏木素浓度为4.5×10-4 mol/L时，苏木素使胰蛋白酶的相对活性下降到70.2%，抑制率为29.8%。在不同的底物浓度（40，30，20，10 g/L酪蛋白溶液）下，按酶活性的测定方法测定酶的反应速度，其结果以1/v对抑制剂量用Dixon作图法求出Ki=6.13×10-5mol/L，抑制类型为非竞争性抑制。

3.2  苏木素对胰蛋白酶紫外吸收光谱影响图1为T＝298K，pH＝7.4时的吸收光谱。蛋白质分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基均有紫外吸收，蛋白质的吸收波长一般在280 nm附近。从图1可以看出，当往胰蛋白酶中加入苏木素后，混合溶液在280 nm附近的吸收峰均明显增高，说明苏木素与胰蛋白酶之间发生了作用，改变了胰蛋白酶的构象,而这种作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基的π－π*电子跃迁。

3.3  荧光光谱以λex＝280 nm，胰蛋白酶在354 nm附近有很强的荧光峰；而以同样激发波长激发苏木素溶液，在354 nm附近则没有荧光峰，证明苏木素不会产生与胰蛋白酶干扰的荧光。固定胰蛋白酶的量，随着体系中苏木素浓度的增加，胰蛋白酶的内源荧光产生有规律的猝灭，其最大发射波长未发生明显的变化（见图2）。

3.4  荧光猝灭常数及猝灭机理

3.4.1  苏木素对胰蛋白酶的猝灭效应一般情况下，可依据不同温度下的结果区别是动态猝灭，还是静态猝灭。对于动态猝灭，随着温度升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度的升高而增大。而对于静态猝灭则温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。本文以相同的实验条件，分别测定了在20，25℃ 下胰蛋白酶的荧光猝灭光谱，以［F0/F－1］对［C］作Stern－Volmer图见图3。从图3可以看出苏木素在温度低于25℃时猝灭常数随温度的升高而降低，即符合静态猝灭机理。

当猝灭体分子和荧光物质分子之间形成新的复合物而发生静态猝灭时，服从Lineweaver-Burk方程。20，25℃时以（F0－F）－1对［C］－1拟合Lineweaver-Burk方程，由图4可见该双倒数呈现良好的线性关系，再次确定在20，25℃时为静态猝灭。

3.4.2  结合位点数n及结合常数KA的计算设苏木素与胰蛋白酶形成n个结合点位的复合物则有：

Lg［（F0－F）/F］＝lgKA+nlg［C］

分别作不同温度下Lg［（F0－F）/F］－lg［C］的双对数拟合，得到不同温度下的KA和n见表1。表1  苏木素与胰蛋白酶的结合常数，结合位点数及相应的相关系数（略）

3.4.3  作用力类型的确定猝灭体与生物大分子之间的相互作用力

主要有氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力。根据以下公式计算。结果见表2。表2  苏木素与胰蛋白酶作用的热力学参数（略）
ln(K2/K1)=△H(1/T1-1/T2)/R

△G=-RTlnK  

△S=(△H-△G) /T

由上可知，△H＜0和△S＜0，可以说明苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力［9］。

3.4.4  苏木素对胰蛋白酶构象的影响固定激发波长与发射波长的间距△λ，扫描同步荧光光谱，这种光谱可用于蛋白质构象变化的分析,由(a)△λ＝20 nm所得到的同步荧光光谱图仅显示的是酪氨酸残基的荧光，(b)△λ＝60 nm时仅表现出色氨酸残基的荧光，由图5可以看出在此实验条件下，酪氨酸和色氨酸残基荧光同时被猝灭，使其荧光强度下降，酪氨酸残基的最大发射波长没有发生改变，但色氨酸残基的最大发射波长发生了蓝移，表明色氨酸基所处环境的疏水性增强，引起了胰蛋白酶的构象变化。

4  结论

苏木素对胰蛋白酶活性可产生非竞争性抑制，抑制剂常数Ki=6.13×10-5mol/L；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭，说明苏木素能与胰蛋白酶形成复合物；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力；苏木素与胰蛋白酶可发生作用，改变了胰蛋白酶的构象，而色氨酸所处环境的疏水性增强显著。

【参考文献】

［1］郑 伟.苏木素染液中媒染剂用量的探讨［J］.解剖学杂志，2006，29（1）：21.

［2］江苏新医学院. 中药大辞典［S］．上海: 上海科学技术出版社，1988：1084．

［3］朱少娟，施用晖，乐国伟.超声波对胰蛋白酶水解酪蛋白的影响［J］.食品与生物技术学报,2005，24（2）:50.

［4］CI OZER．Kinetic analysis of enzyme inactivation under second-order conditions by use of substrate-to-product progress curves：Application to inhibition of trypsin by α-1 protease inhibitor［J］．Analytical Biochemistry，1998，264：199.

［5］AI Qing，SHI Gui-xin，BEI Jian-zhong，et a1．Enzymatic degradation behavior and mechanism of poly(1actide-coglycolide) foams by trypsin［J］．Biomaterials，2003，24：629.

［6］刁家志，陆 珊，赵 巍，等.葛根素与胰蛋白酶相互作用研究［J］.化学研究与应用，2006， 18（3）：280.

［7］王兴明，黎泓波，胡亚敏，等.苏木素与DNA相互作用的光谱研究［J］.化学学报，2007，65（2）：140.

［8］张龙翔．生化实验方法和技术，第2版［M］．北京：高等教育出版社，1997：144.

［9］Kojiro Shimojo，Tatsuya Oshima，Masahim Goto．Calix［6］ arene acetic acid extraction behavior and specificity with respect to nucleobases［J］．Analytica Chimica Acta，2004，521：163.