自拟方宝宁丸由醋制鳖甲、生黄芪、生山药、炒莱菔子、炒白术、防风、炒枳实等14味中药组成。本方由我校中医学教授黄德友、马荣华创制，已在一附院、二附院(原南阳张仲景国医学院附属医院)临床应用十余年。观察240余例，除有效预防小儿感冒外，对积滞、厌食证可健脾和胃，改善其消化功能;对腹痛、腹胀症状可行气导滞、缓急止痛;对鼻炎、扁桃体炎可抗菌消炎，防止反复感染[1]。为了验证宝宁丸的“安内攘外，扶正祛邪”的临床疗效，我们开展了宝宁丸对小鼠免疫功能影响的实验观察。

1 材料与方法

1.1 药物及制备

醋制鳖甲、银柴胡、生黄芪、生山药各10 g，炒莱菔子、防风、炒枳实各4 g，炒白术5 g，炒麦芽、炒神曲、鸡内金各6 g，由我校二附院中药饮片厂制剂教学科研基地按比例制成散剂。实验前浸泡24 h(温度为0～4℃)，过滤去渣取上清液，配成浓度为50 g/L的溶液备用。

1.2 动物清洁级昆明小鼠，由南阳医学高等专科学校实验动物中心提供，小鼠体质量18～22 g，雄性，饲养于清洁级实验室内。

1.3 血清抗体效价测定

1.3.1 实验分组小鼠32只，按体质量配对后随机分为两组，宝宁丸组(B组)和对照组(C组)各16只，B组以50 g/L的宝宁丸溶液灌胃，2次/d，C组以生理盐水灌胃，2次/d。

1.3.2 血清抗体的诱导产生用100 μg·ml-1牛血清白蛋白作为抗原在1,4,8周对小鼠腹腔注射，第1次注射剂量为0.3 ml，第2次注射剂量0.4 ml，第3次注射剂量0.5 ml。

1.3.3 取血尾静脉取血，用免疫双向扩散法测小鼠血清抗体效价。在1∶16以上时即达到要求，第9周时集体处死。处死前将小鼠禁食24 h，以免血脂过高。用断头法处死小鼠，每只小鼠分别取血置于1 ml离心管中。常温静置1 h，4℃过夜，使血块收缩，将血块自容器壁分离，将血清全部倾入离心管。4℃下2 500 r/min离心30 min，取上清部分与前面血清混合，3 000 r/min离心5 min取上清液，即为所需血清。

1.3.4 血清抗体效价测定准备10支试管，分别加入生理盐水0.5 ml。在第1管内加小鼠血清0.5 ml，混匀后吸出0.5 ml注入第2管，同样混匀后吸出0.5 ml于第3管，依此类推，稀释到第9管，第9管混匀后弃去0.5 ml，第10管不加小鼠血清，只加0.5 ml生理盐水。第1到第9管的稀释倍数分别为2，4，8，16，32，64，128，256，512倍。每管中再加入100 μg·ml-1牛血清白蛋白0.5 ml。混匀后室温放置60 min，以出现明显凝集的试管的稀释倍数为血清抗体效价。

1.4 小鼠腹腔巨噬细胞功能测定

1.4.1 鸡红细胞悬液的制备[2]于无菌操作下，自鸡翼下静脉采血，置Alsever's溶液中，高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存。临用时，用生理盐水洗涤3次，离心弃去上清液，用生理盐水配成20 ml/L(V/V)。

1.4.2 实验分组取小鼠30只，按体质量配对后随机分为宝宁丸组(B组)、卡介苗组(K组)和生理盐水组(C组)，每组各10只，分笼饲养。按表1给药。表1 小鼠腹腔巨噬细胞功能测定动物分组及给药情况(略)

4周后，每鼠腹腔注射20 ml/L(v/v)鸡红细胞悬液1.0ml。间隔30 min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2.0 ml，转动鼠板，吸出腹腔洗液1.0 ml，平均分滴于2片载玻片上，移置(37±1)℃孵箱温育30 min，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，40 ml/L (V/V)Gimsa-磷酸缓冲液染色3 min，再用蒸馏水漂洗，凉干。镜检，计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞总数，计算吞噬百分率和吞噬指数。计算公式为：吞噬百分率(%)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞(吞及未吞的)×100%，吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞(吞及未吞的)÷2。

2 结果

2.1 血清抗体效价通过对两组32管小鼠血清抗体效价的测定，得到B组血清中抗体效价明显高于C组。B组血清抗体效价以1∶128为主，占样本总量的62.50%;其次为1∶256，占样本总量的18.75%;再次为1∶64，占样本总量的12.50%，1∶512，占样本总量的6.25%。C组血清抗体效价以1∶32为主，占样本总量的56.25%;其次为1∶64，占样本总量的25.00%，再次为1∶16，占样本总量的18.75% (见表2)。此结果表明宝宁丸组的小鼠体液免疫功能高于对照组。表2 宝宁丸组与对照组血清抗体效价对比(略)

2.2 小鼠腹腔巨噬细胞功能实验表明，B组对鸡红细胞的吞噬百分率为71.35%，吞噬指数为1.31，K组的吞噬百分率为68.30%，吞噬指数为1.28，C组吞噬百分率为61.05%，吞噬指数为1.05(见表3)。B组、K组分别与C 组进行统计学对照处理，宝宁丸、卡介苗均能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。表3 各组玻片巨噬细胞计数、吞噬百分率及吞噬指数(略)

3 讨论

遵照中医理论，宝宁丸中黄芪、白术为君，益气固表，健脾助运，此两味药配伍，其意在于“补虚黄芪为墙垣，以白术为基址……可至风雨不畏，寒暑不侵，向来体弱者不觉脱胎换骨”[3];防风辛散，助主药通行肌表;山药健脾益气，以实中焦，共为臣药;麦芽，神曲，鸡内金消食健脾;莱菔子行气导滞;鳖甲、银柴胡消积清热为佐;使以甘草调和药味，缓急止痛。诸药共奏益气固表、健脾消积、培土生津之效。药理学实验研究资料也表明：黄芪有增强机体免疫力的作用，并具一定的镇痛、抗菌、抗病毒作用;白术调节胃肠功能，强壮机体;防风解热镇痛、抗菌、抗病毒、抗过敏、增强机体非特异免疫;莱菔子抑制细菌生长、解毒、抗炎、镇痛;山药具有诱导机体产生干扰素、提高巨噬细胞吞噬功能和体液免疫功能的作用[4]。

本实验通过对血清抗体效价的测定，显示宝宁丸组的小鼠体液免疫功能高于阴性对照组，说明宝宁丸有提高机体体液免疫功能的作用;对小鼠腹腔巨噬细胞功能测定

时选择了卡介苗作为阳性对照，卡介苗为预防结核病的减毒活疫苗，还可有效地增强机体的细胞免疫功能，故现可作为免疫增强剂，用于治疗恶性黑色素瘤，或在肺癌、急性白血病、恶性淋巴瘤根治性手术或化疗后作为辅助治疗，口服还可用于小儿哮喘性支气管炎的治疗、小儿感冒的预防以及成人慢性气管炎的防治[5,6]，实验显示宝宁丸组对鸡红细胞的吞噬百分率及吞噬指数与阴性对照组有显著的统计学差异，且略高于卡介苗，说明宝宁丸能显著提高细胞免疫功能。本实验研究结果与中医理论相吻合，且说明中药在增强免疫功能方面甚至优于某些西药。