北豆根为防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum DC.的干燥根茎，其有效部位是生物碱。现已知北豆根中含有近20 种生物碱，总碱含量可达1%以上，其中含量最高的生物碱为蝙蝠葛碱，其含量约占总生物碱的50%左右[1] 。北豆根总碱(TAMD)对呼吸道致病菌有抑菌作用，尤其对肺炎球菌效果更为显著。其制剂北豆根片可治疗急性咽炎、扁桃体炎，经过多年的临床应用已收入2005 版《中国药典》。2005 版《中国药典》用酸碱滴定法控制含量，终点不易判断，误差大。本实验采用酸性染料比色法测定提取物中TAMD 的含量，采用高效液相色谱法测定提取物中蝙蝠葛碱的含量，从而用这两个指标控制提取物的质量。

1 　器材

HP -8453 紫外-可见分光光度计;AG -254 型电子分析天平(瑞士梅特勒);WT -02 型电热恒温干燥箱(北京恒星医疗器械厂);ZFQ -85A 型旋转蒸发仪(上海医械专机厂);R2002 型旋转蒸发仪(上海申顺科技公司);JASCO 高效液相色谱仪(UV -15 紫外-可见检测器，RU -1580 泵，CKChom 色谱工作站，日本);北豆根饮片(市售，承德产，经鉴定为蝙蝠葛);北豆根碱(对照品，自制，含量99.0%);95%乙醇、氨水、硫酸、三氯甲烷、无水甲醇、磷酸、酚酞为分析纯; 甲醇、乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 酸性染料比色法测定提取物中TAMD 的含量[2]

2.1.1 比色原理不吸收可见光的无色物质通过络合、氧化还原等反应生成有色物质，可用于比色测定。实验证明，溴甲酚绿在无水甲醇(pH =6)中，可与TAMD 直接络合生成绿色化合物，用于比色测定。

2.1.2 最大吸收波长的选择精密称取蝙蝠葛碱对照品(60℃干燥至恒重)10.0 mg 置50 ml 容量瓶中，加无水甲醇溶解，最后用无水甲醇定容至50 ml，作为对照品溶液。

精密吸取对照品溶液1.0 ml 置10 ml 容量瓶中，加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml，用无水甲醇定容，在200 ～700 nm 进行扫描，选择最大吸收波长，确定最大吸收波长为620 nm。

2.1.3 显色剂用量的考察分别精密吸取0.1%溴甲酚绿溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 ml 置10 ml 容量瓶中，再分别加入对照品溶液1.0 ml，用无水甲醇定容，在620 nm 处测定吸收度。结果见表1。

表1 蝙蝠葛碱与溴酚绿络合后的吸收度(略)

结果表明，显色剂用量为0.2 ml 时吸收度最大，故选用显色剂用量为0.2 ml。

2.1.4 显色稳定性的考察以加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml的样品为考察对象，在120 min 内于620 nm 处测定吸收度，随行试剂空白。结果见表2。

表2 蝙蝠葛碱的显色稳定性考察(略)

平均吸收度为0.423，RSD为0.03%，表明吸收度在120 min内没有明显变化。

2.1.5 标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液0.3，0.5，0.8，1.0，1.2，1.5，2.0 ml，置10 ml 容量瓶中，加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml，于620 nm 测定吸收度，随行试剂空白。以蝙蝠葛碱浓度C 对吸收度A 进行线性回归，得标准曲线方程：C =49.91A -0.88，r =0.999 8 (n =7)，线性范围为6 ～40 μg· ml-1 。

2.1.6 精密度实验取2.1.5 中的样品(20 μg· ml-1 )测定吸收度，重复测定5 次，平均吸收度为0.423，RSD 为0.11%。

2.1.7 加样回收率实验精密称取北豆根提取物2.0 mg(总碱含量以北豆根碱计为92.7%)，置10 ml 容量瓶中，加无水甲醇使溶解，超声提取15 min，用无水甲醇定容至10 ml，总碱浓度以蝙蝠葛碱计0.185 mg· ml-1 。蝙蝠葛碱对照品溶液浓度为0.2 mg· ml-1 。分别精密吸取两种溶液各0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 ml，一一对应混合于10 ml 容量瓶中，无水甲醇定容。测定结果见表3。

表3 TAMD的回收率(略)

2.2 高效液相色谱法测定提取物中蝙蝠葛碱含量[3]

2.2.1 色谱条件色谱柱：Discovery -C18 (5 μm，4.6 mm ×250 mm);流动相：乙腈∶水∶磷酸=16∶84∶0.15(V∶V∶V);流速：0.5 ml· min-1;波长208 nm;柱温：室温;进样量20 μl;理论塔板数2 300。

2.2.2 北豆根对照品、提取物和药材的HPLC 的图谱见图1。

图1 北豆根对照品提取物和药材的HPLC图谱(略)

2.2.3 标准曲线的绘制精密称取蝙蝠葛碱对照品(60℃干燥至恒重)5.0 mg 置25 ml 容量瓶中，用流动相溶解并定容，作为对照品溶液。分别精密吸取对照溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0 ml 置10 ml 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，按上述条件进行检测，以峰面积(Y)对浓度(X)进行直线回归，得回归方程为：Y =1.53 ×108 X +1.18 ×104 ;r =0.999 8 (n =7) ， 线性范围为0.01 ～0.1 mg· ml-1 。

2.2.4 精密度实验选用“

2.2.3”项浓度为0.04 mg· mol-1 的样品，连续进样5 次，计算峰面积，平均峰面积为6058030，RSD 为0.15%。

2.2.5 加样回收率实验精密称取10.0 mg 北豆根提取物(蝙蝠葛碱含量为48.06%)置50 ml 容量瓶中，加入流动相溶解，超声提取15 min，用流动相定容，浓度为0.089 2 mg· ml-1 。蝙蝠葛碱对照品溶液浓度为0.2 mg· ml-1 。精密吸取样品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml 置10 ml 容量瓶中，分别加入对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 ml，用流动相定容后测定含量。结果见表4。

表4 蝙蝠葛碱的回收率(略)

2.3 　含量测定

2.3.1 北豆根药材的处理[4] 饮片粉碎过40 目筛，60℃干燥。称取1.0 g 置索氏提取器中，加入氯仿30 ml，氨水1.0 ml，浸泡24 h。再加入氯仿50 ml，80℃水浴回流3 h，水浴蒸干氯仿。残渣用无水甲醇溶解，溶液转移置50 ml 容量瓶中，无水甲醇定容，作为备试溶液。

2.3.2 北豆根提取物的处理精密称取北豆根提取物(60℃干燥至恒重)2.0 mg 置10 ml 容量瓶中，加无水甲醇溶解，过滤，洗涤容器及滤器3 次，合并滤液及洗液，用无水甲醇定容至10 ml备用。

2.3.3 　北豆根药材中TAMD 的测定取备试溶液1.0 ml 置10ml 容量瓶中，加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml，用无水甲醇定容，于620 nm 测定吸收度，随行试剂空白。根据回归方程计算TAMD 含量。经测定，本实验所选用的北豆根药材中TAMD 含量为1.23%。

2.3.4 北豆根药材中蝙蝠葛碱的测定取备试溶液3.0 ml 置10 ml 容量瓶中，挥干甲醇，加入流动相适量，振摇使溶解后用流动相定容。照色谱条件测定峰面积。根据回归方程计算蝙蝠葛碱含量。经测定，本实验所选用的北豆根药材中蝙蝠葛碱的含量占TAMD 的45.76%。

2.3.5 北豆根提取物中TAMD 的测定取备试溶液0.5 ml 置10 ml 容量瓶中加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml ，用无水甲醇定容，于620 nm 测定吸收度，随行试剂空白。根据回归方程计算TAMD 含量。经测定，本实验所得到的北豆根提取物中TAMD 含量为92.71%。

2.3.6 北豆根提取物中蝙蝠葛碱的测定取备试溶液2.0 ml 置10 ml 容量瓶中(浓度为4%)，挥干甲醇，加入流动相适量，振摇使溶解后用流动相定容。照色谱条件测定峰面积。根据回归方程计算蝙蝠葛碱含量。经测定，本实验所得到的北豆根提取物中蝙蝠葛碱的含量占TAMD 的48.06%。

3 讨论

中药质量标准的研究一直是中药现代化研究中的重要组成部分。由于中药成分复杂或有效成分不明确，有些直接以原药材或粗提物入药，使得很多中药的含量测定成为难点。近年来，一些现代化技术的应用推动了中药有效成分的提取、分离和含量测定的研究。《中国药典》2005 版收录的北豆根片中只规定了TAMD 的含量测定，方法为酸碱滴定法。由于各地北豆根药材中，TAMD 的组成有差别[4] ，只控制TAMD 的含量尚不能全面反映制剂所需的原料和成品的质量。本实验测定了单体蝙蝠葛碱在总碱中的含量，进一步完善了提取物和制剂的质量标准。酸碱滴定法操作复杂，终点不易判定，误差大。本实验采用酸性染料比色法测定TAMD 含量、采用高效液相色谱法测定蝙蝠葛碱含量，操作简单，方法专属性强，灵敏度高。