睾丸功能的减退与男性衰老之间存在着重要的联系。近来多项研究表明，从50岁开始，随着年龄的增长，男性由于睾丸雄激素合成功能逐步衰退而引起一系列的临床综合征称为中老年男性部分雄性激素缺乏综合征(PADAM)[1]。中医学认为肾虚是衰老的主要原因，现代研究也证明肾虚与衰老密切相关，补肾方药确有延缓衰老作用[2-3]。为了探讨补肾生精方药延缓衰老的机理，我们应用蛋白质组学技术，观察了补肾生精颗粒对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 固相 pH梯度(immobilinepHgradient,IPG)胶条、尿素、硫脲、二硫苏糖醇(DTT)、甘油、蛋白质相对分子量标记、3?[3?(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、胶条缓冲液(IPG buffer)、凝胶条覆盖液、胶槽清洗液、过硫酸胺(APS ),十二烷基磺酸钠(SDS)均购自Amersham biotech公司;复合蛋白酶抑制剂(proteasein hibitorco cktail)购自Pierce公司;碘乙酞胺、体积分数37%甲醛溶液、三氟乙酸(FA )、乙腈(ACN )均购自Sigma公司;胰蛋白酶购自Promega公司;低熔点琼脂糖、硫代硫酸钠、牛血清白蛋白(BSA )均购自上海生工公司; 乙酸、无水乙醇、甲醇、硝酸银、无水碳酸钠、乙二胺四乙酸钠(EDTA?Na+ )、考马氏亮蓝R?250、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸均为国产分析纯。等电聚焦系统(IPG?phor)、GS?800凝胶成像仪、 ImageMaster 2D platinum software 5.0 软件均由美国BIO?RAD提供; 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 (MALDI?TOF，AMERICA APPLY SYSTEM)。

1.2 药物制备 补肾生精颗粒主要由菟丝子、枸杞子、淫羊藿等组成，由广东省中医院制剂室提供(批号：06071802)。配成浓度为50mg/L混悬液，灭菌后4℃保存备用。

1.3 动物及分组 选用22月龄老年雄性SD大鼠20 只(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：医动字06?49?3)，随机分为2组，每组各10只，分别为空白对照组(灌喂等容积生理盐水)和补肾生精组(给药剂量为0.05g·kg-1·d-1)，连续给药2个月。

1.4 蛋白抽提与定量 以30g/L戊巴比妥 20mg/kg腹腔注射麻醉动物;取大鼠右侧睾丸，剥去白膜，迅速置于液氮中，研碎;加入适量蛋白抽提试剂[8mol/L 尿素、0.2g/L CHAPS、20 mmol/LDTT、1 mmol/L EDTA，1 mmol/L苯甲基磺酸氟(PMSF) 以及蛋白酶抑制剂混合物];震荡溶解后，室温孵育1 h，离心(4℃、12 000 g) 15 min，取上清，分装保存于-70℃冰箱;蛋白定量采用Bradford 法。

1.5 双向电泳 选取pH值为3～10的线性IPG胶条，采用IPG?phor System 进行第一向等电聚焦。取1mg蛋白，溶于重泡胀液(8 mol/L 尿素、0.2g/L CHAPS、0.02 mol/L DTT、0.5g/L IPG 缓冲液);将聚焦后的胶条在SDS 平衡液(6 mol/L 尿素，20g/LSDS，1.5 mol/L Tris?HCl、pH 8.8，体积分数30% 甘油)中平衡2次(摇床上振荡)，每次15 min。其中，第1次平衡液中加入20 mmol/L DTT，第2次平衡液中加入100 mmol/L 碘乙酰胺;取出胶条在PROTEN II xi Cell 上进行垂直方向的第二向电泳，即SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒流40 mA，40 min;置固定液(乙醇和乙酸的混合水溶液，含体积分数40% 乙醇、10% 乙酸)中固定30 min;用1g/L 考马斯亮蓝染液R?250进行凝胶染色3 h，脱色过夜。

1.6 图像分析 采用凝胶成像仪扫描成二值图像格式(TIFF 格式)图像(分辨率为300 dpi)，然后用ImageMaster 2D platinum software 5.0 软件进行差异分析。

1.7 酶切和质谱分析 观察差异蛋白点在凝胶上的原始位置，切下满足下面两个条件的蛋白点进行质谱分析：(1)在4次重复胶上均能找到，且差异显著;(2)无明显拖尾、变形，且完全分离。将蛋白胶粒均匀切碎，置1.5 mL 离心管中，用去离子水清洗2 次，加入脱色液(体积分数50% 乙腈、25 mmol/L 碳酸氢铵) 100 μL，摇床振荡20 min，弃去溶液，重复2 次，直至胶片中的蓝色脱尽，真空离心干燥;加入适量胰酶液(0.01μg/μL，含25 mmol/L碳酸氢铵，5mmol/L 氯化钙)，置于4℃冰箱泡胀20～30 min，酶液被完全吸收后，补充5～10 μL 酶解缓冲液，37℃过夜(约16 h); 离心，吸取1 μL 酶解液，与饱和基质溶液α

? 氰基?4? 羟基肉桂酸 (α?CCA)充分混匀后点靶，进行质谱分析。

1.8 生物信息学分析 登陆NCBI网站对质谱分析鉴定的差异表达蛋白进行结构域分析。 2 结果

2.1 老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的变化 提取睾丸蛋白，对空白对照组和补肾生精组大鼠的睾丸蛋白一起进行双向电泳，其代表性考马斯亮蓝染色电泳图谱见图1。ImageMaster 2D platinum software5.0 软件分析结果表明，平均每块凝胶上可找到600 个左右蛋白点。选取空白对照组中一块凝胶作参照，其蛋白点匹配率为89%，补肾生精组蛋白点匹配率为87%，保证了良好的重复性。

2.2 差异蛋白点的质谱分析 选取并切下满足条件的蛋白点(补肾生精组与空白对照组之间表达水平上调5倍以上和下调0.2倍以下的蛋白点)，共分析了7个差异表达蛋白点，其中4个蛋白点在补肾生精组表达高于空白对照组，其他3 个点相反。胶内酶切后，进行质谱鉴定及查库分析。其中5种蛋白分别鉴定为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine?binding protein, PEBP)、热休克蛋白8 (heat shock 70 kDa protein 8，HSP7C)、磷酸丙糖异构酶(triose?phosphate isomerase，TPIS)、3?磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH)、谷胱苷肽?S?基转移酶1(glutathione S?transferase Mu 1 ，GSTM1?1)。其中，在补肾生精组中HSP7C和GSTM1?1蛋白表达下调，而PEBP、TPIS和GAPDH 蛋白表达上调。该5种蛋白的酶切产物质谱分析色谱图见图2。

3 讨论

中医学认为肾主生殖。有研究表明[2]，机体老化是一种生理性肾阳虚，肾阳虚是未老先衰的一种表现。睾丸功能的减退与男性衰老之间存在着重要的联系。肾阳虚证具有下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)功能紊乱，补肾中药能明显提高男性老年人血清睾酮水平，能改善老年大鼠睾丸间质细胞曲细精管的结构。

补肾生精颗粒主要由菟丝子、枸杞子、淫羊藿等组成，具有补肾生精之功效。我们临床用于治疗男性更年期综合征、男性不育症、少弱精子症等病均具有较好疗效。现代药理研究证明[4]，方中淫羊藿辛温，入肝、肾经，补肾助阳，含锌、锰水平较高，具有雄性激素样作用，`能兴奋性机能，使精液分泌亢进，为精子获能创造良好的内环境。菟丝子主要补养肝肾、益精，能促进性腺及附属性腺发育，提高精子质量，对过氧化损伤(ROS)造成的精子膜、顶体结构和精子线粒体功能损伤具有明显的干预作用。

本实验共分析了7个差异表达蛋白点，其中4个蛋白点在补肾生精组表达高于空白对照组，其他3个点相反，且HSP7C和GSTM1?1蛋白在补肾益精组中表达下调，而PEBP、TPIS和GAPDH 蛋白表达上调。PEBP又称为Raf 激酶抑制蛋白( RKIP)，是Raf/MAPK 信号通路的调节子和转移性肿瘤(metastatic cancer)抑制剂[5]，PEBP可能与生精过程中生殖细胞分裂活动有关。热休克蛋白基因hsp70?2、hsc70t是生精细胞特异表达基因[6]，其中hsc70t在减数分裂后表达，hsp70?2敲除雄性大鼠的精子产生被阻断在第一次减数分裂，导致不育，而雌性大鼠正常。免疫共沉淀和体外结合实验显示hsp70?2在大鼠睾丸中直接与周期蛋白依赖性蛋白激酶1(CDK1)作用，表明它可能作为分子伴侣参与CDK1和细胞周期蛋白cyclin B1形成M期促进因子(MPF)复合物。GSTM1?1是二聚体蛋白[7]，除在肝脏大量表达外，还存在于睾丸组织，催化还原性谷胱苷肽与化学物质贩亲电子基团结合，对精子的抗氧化损伤具有保护作用。TPIS是糖酵解途径的关键酶，附睾精子糖酵解活动受到抑制则能产生抗生育作用。精子尾巴的运动产生了精子的运动力，但这种运动需要ATP提供足够的能量[8]。一般认为，细胞中的线粒体能够提供精子运动所需的ATP。精子运动力和ATP的制造主要依赖于糖酵解过程，GAPDH能够紧密地结合到精子尾巴的特定结构区域上。利用基因靶向或称基因敲除技术制造出缺失这种酶的小鼠，因为缺少GAPDH，小鼠精子中的糖酵解就被有选择地抑制并因此无法产生ATP，雌性小鼠表现正常，而雄性小鼠具有正常的睾丸和精虫数却无法授精。显微镜观察结果表明缺少GAPDH的精子缺乏运动力。糖酵解并不能像线粒体那样高效地制造出能量，但是这个途径中的GAPDH酶却对精子的运动非常重要[9]。因此，这项研究证明GAPDH可能是避孕药剂的一个有效的靶标。

本研究通过观察补肾生精法对衰老过程睾丸蛋白表达的影响，有助于从蛋白质组水平阐释中医肾主生殖以及补肾中药延缓睾丸衰老的本质。