地榆Sanguisorba officinalis L.是蔷薇科(Rosaceae)地榆属Sanguisorba L.植物的根及根状茎,具有凉血止血，解毒敛疮功效。主要分布于中国东北 、华北 、西北 、华东 、中南及广西 ，广布于欧洲和亚洲北温带，主要成分为鞣质和三萜皂苷。研究表明地榆提取物能对抗ONOO-的肾损害作用，抑制细胞凋亡，改善氧化应激和氧化损伤作用[1～3]。国外Katsumata[4]报道抗氧化剂可以有效治疗过敏性疾病，因为活性氧如超氧阴离子自由基、羟自由基促使肥大细胞释放组胺，产生过敏反应，因此，从地榆的成分以及抗炎症、抗氧化的效果看，地榆可能是良好的抗过敏植物来源。

但是从目前的文献报道来看，地榆的抗过敏研究报道较少，主要集中在地榆的粗提物上，如地榆水提液可以明显使实验小鼠增强2，4-二硝基氯苯所致迟发型过敏反应，使鼠耳重量增加，具免疫增强作用[5]。地榆根的粗提物能够抑制组胺介质的释放和TNF-α的产生，具有良好治疗即时型过敏的效果[6]。虽然Park KH通过老鼠的被动皮肤测试及由compound 48/80 和Ca2+引发的过敏测试，表明了地榆对肥大细胞的抑制作用，其主要作用成分为5-O-α-D-(3-C-羟甲基) 呋喃来苏糖基-β-D-(2-羟甲基)阿拉伯呋喃糖的双糖[7]，但没有更多的报道过抗过敏的有效成分。鉴于纯天然植物的安全无副作用以及地榆的研究现状，本文对地榆的粗提物进行了初步分离，探讨地榆提取物的抗氧化与抑制透明质酸酶间的作用和内在的关系，为抗过敏植物资源的开发提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 试剂透明质酸钾、透明质酸酶，Sigma公司产品;对-二甲氨基苯甲醛(AR)，上海试剂二厂产品;乙酰丙酮，天津试剂厂产品;邻二氮菲，北京爱芳医药化工研制公司产品;过氧化氢，中国医药(集团)上海化学试剂公司产品;三(羟甲基)氨基甲烷，成都科龙化工试剂厂产品。

1.2 材料地榆，购于南宁市国人大药房。

1.3 仪器大孔树脂HP-20，北京绿百草公司产品;紫外分光光度计，日本岛津产品;恒温水浴锅，北京市医疗设备厂产品;微量移液器，上海精密仪器厂产品;冷冻液循环泵，郑州长城科工贸有限公司产品;真空冷冻干燥系统，美国LABCONCO公司产品。

2 方法

2.1 提取分离方法取地榆500 g，采用60%乙醇,70℃提取，冷冻干燥得到粗提物A，粗提物依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，并分别冷冻干燥得到样B，样C，样D，以及萃余物水相E组分;用大孔树脂HP-20对样E进行分离,洗脱体积均为2 BV,流速:1 BV/h,长径比:12∶1，收集水、10%乙醇、40%乙醇和70%乙醇4部分的洗脱液， 冷冻浓缩干燥分别得到样F，样G，样H，样I 4个样品。

2.2 透明质酸酶抑制率实验抗过敏活性检测：Elson-Morgan 改良法[8]的方法进行测定，并计算各个样品的抑制率。

2.3 抗氧化实验

2.3.1 羟基自由基的测定[9]将样品配成浓度为0.4 mg·ml-1的溶液，取3只试管，分别加入2 ml pH=7.4的磷酸盐缓冲液，1 ml 1.5mmol·L-1的邻二氮菲溶液，充分混匀后，再加入1 ml 1.5mmol·L-1 FeSO4溶液，每加1管立即混匀，然后向其中1支试管加入1 ml的溶液(每次所加的体积不同)，混匀。另两支试管分别为损伤管和未损伤管，

不加洗脱溶液，再分别加入0.02%的H2O2 1 ml，未损伤管不加H2O2，最后补充各管体积至8 ml。于37℃下保温1 h，测在510 nm下的吸光度，重复两次，计算其平均值。

OH的清除率(%)=[(A2-A1)/(A0-A1)]×100%

A0：未损伤管的吸光度;A1：损伤管的吸光度;A2：加样品并扣除样品空白后的吸光度。

2.3.2 过氧化氢清除实验[10]清除过氧化氢能力的测定按文献方法并加以改进，以pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液配制10 mmol·L-1H202溶液，取5 ml上述溶液加入5 ml样品液(0.4 mg·ml-1)，混匀后用紫外分光光度计测定其在230 nm处的吸光值A1，实验中以不加样品液的H2O2溶液吸光值为A0，以不加H2O2溶液的样品溶液的吸光值为A2。

过氧化氢的清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

2.3.3 DPPH清除实验[11]分别取2 ml不同浓度的试样液于试管中，加入 2×10-4mol·L-1的DPPH· 溶液2 ml，混合均匀，反应30 min后在517 nm处测定其吸光度，同时测定试样空白以及不加试样液的空白样的吸光度。按下式计算其对DPPH· 抑制率：

DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100% 式中：A1=2 ml DPPH· 溶液+2 ml试样液的吸光度;A2=2 ml试样液+2 ml无水乙醇的吸光度; A0=2 ml DPPH· 溶液+2 ml无水乙醇的吸光度。

3 结果

3.1 各提取物的透明质酸酶抑制率原花青素、儿茶素都具有强有力的抗氧化作用，抗过敏作用。从表1可以看出，样A经溶剂萃取后得到样E，样E经大孔树脂纯化后得样H，其透明质酸酶的抑制率分别为47.70%，62.00%，76.00%，逐步升高。样H的活性超过儿茶素，且提取率相对于其他样品是较高的，因此选择A，E，H作为下面抗过敏与抗氧化作用量效分析的样品。从羟基自由基清除率与过氧化氢清除率来看，样H的清除率是所有提取物最高的，其自由基清除率接近于原花青素和芦丁，大于维生素C和儿茶素;过氧化氢清除率接近于原花青素，大于芦丁、维生素C、儿茶素。因此，样H在本实验中显示了与原花青素相近的活性。

本实验对样品H进行了试管预测：①样品H可以使明胶溶液产生沉淀,推断为单宁类物质;②样品H喷洒三氯化铁-铁氰化钾显示为蓝色,喷洒茴香醛-硫酸,样品颜色显示为橙黄色,证明样品H为缩合类单宁;③加入溴水,样品H溶液变浑浊,推测为缩合类单宁;④样品H加入香草醛-盐酸溶液,颜色呈现红色,推测样品为缩合类单宁。

此结果证实样品H为与原花青素相似的缩合单宁类。表1 不同样品自由基清除率和透明质酶抑制率(略)

3.2 不同浓度的提取物的透明质酸酶抑制率的比较Kakegawa[12]等(1985)曾报道各种影响肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶的活性，透明质酸酶活性抑制和肥大细胞释放组胺之间有很好的相关性。近年来，日本、韩国[13，14]等国家已将透明质酸酶活性的抑制实验作为基本方法之一，从天然产物中大量筛选抗变态反应化合物。

由图1可看出，地榆大孔树脂40%乙醇洗脱物在1 mg/ml抑制率已达76%，较低浓度0.5 mg/ml的抑制率达50%，可见地榆大孔树脂40%洗脱物对透明质酸酶有很强的抑制作用。地榆萃取后水相(E)及地榆醇提物(A)也都表现了明显的抑制透明质酸酶作用。在提取分离的过程中,通过不同极性溶剂的萃取分离,以及大孔树脂的吸附分离,透明质酸酶抑制率在每一步分离纯化过程都得到提高,说明地榆中抗过敏成分得到了很好的富集。

3.3 不同提取物对氧自由基的抑制作用的比较

3.3.1 对羟自由基的清除作用

由图2可知，地榆提取物A,E,H对羟自由基的清除作用，在所给范围内，随着浓度的升高，清除作用也逐渐增强，呈量效关系，在一定浓度范围内，清除能力与样品浓度呈正相关。经计算地榆各样品的IC50 (清除率达到50%时的样品浓度)分别为：0.4，0.42 ，0.26 mg/ml。

3.3.2 对过氧化氢(H2O2)的清除作用由图3可以看出，地榆3种提取物对H2O2有不同的清除效果，说明地榆多酚对H2O2有明显的清除作用，且呈较好的量效关系。地榆萃取后水相物在低浓度范围内清除率上升的比较快，在高浓度范围内上升的较为缓慢。地榆大孔40%洗脱物清除能力相对最强，特别是低浓度范围内表现明显，在0.1 mg/ml，清除率就达到63%。经计算地榆提取物清除H2O2的IC50分别为：0.160，0.098，0.060 6 mg/ml。

3.3.3 对DPPH的清除作用DPPH法是一种评价天然抗氧化剂抗氧化活性的快速、简便、灵敏、可行的方法，对自由基清除剂具有广谱性筛选效果，在国内外应用广泛。由图4可知，地榆提取物对DPPH的清除都呈正相关，是一种良好的天然抗氧化剂。经计算地榆各样品的IC50 (清除率达到50%时的样品浓度)分别为： 0.49，0.121，0.089 mg/ml。

4 结论

大孔树脂用于分离黄酮类、皂苷类、生物碱、多酚等。样品通过大孔树脂吸附，水洗脱物一般为糖类、蛋白质等，因此推断40%洗脱物H主要成分应该是多酚类物质，而不是已被证明的地榆中具有抗过敏性的多糖类物质。实验证明其抗过敏性与原花青素相近，原花青素已证明有良好的抗过敏和抗氧化活性[15]，并已开发成产品如安佐康胶囊。因此推断地榆多酚是一种良好的抗过敏、抗氧化物质。

通过样A，E，H的不同浓度的透明质酸酶抑制率和对氧自由基的抑制作用的比较，透明质酸酶抑制率与清除氧自由基具有共同上升的趋势，说明地榆提取物的透明质酸酶抑制率与氧自由基清除率之间具有一定的正相相关性，这可能与地榆鞣质分子结构中存在大量的羟基或某些羟基的特定位置有关。可以预测地榆抗过敏机制与其具有较强的氧自由基清除作用有关, 能有效阻断致敏物质的释放，从而去除过敏症状。这将对地榆抗过敏作用的机制研究上提供帮助。