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作者：张友恩，王家宁，唐俊明，郭凌郧，杨建业，黄永章，郑飞，孔霞

【摘要】 目的： 研究PEP?1?SOD1融合蛋白转导进入大鼠心肌组织的能力，并测定转导的目的蛋白酶活性. 方法： 实验分为SOD1组和PEP?1?SOD1组，分别经大鼠尾静脉注射500 μg纯化后的SOD1及500 μg纯化后的PEP?1?SOD1融合蛋白入大鼠体内，于注射后 0.5，1，2，4，8，24 h时间点取心脏(n=6，每组，每个时间点)，经40 g/L多聚甲醛溶液固定 6 h后行冰冻切片，通过免疫组织化学方法检测PEP?1?SOD1进入大鼠心肌组织的能力和分布情况. 黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织SOD1 活性. 结果： PEP?1?SOD1组注射后0.5 h时，大鼠心肌组织中即出现均一的明亮红色荧光信号，分布于细胞浆及细胞核，具有时间依赖性的特点，荧光强度最强点为1 h 时间点，而SOD1组未见到红色荧光信号. 于注射后0.5 h时SOD1活性开始升高PEP?1?SOD1组为(85.37±1.67)，SOD1 组为(52.23±0.67)，两组相比较，差异具有统计学意义(P<0.01);注射后1 h时SOD1 活性可达高峰，PEP?1?SOD1组为(119.16±1.37)，SOD1 组为(53.47±1.02)，两组相比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，2～24 h逐步下降;SOD1组各时间点间相比较差异无统计学意义(P>0.05). 结论： PEP?1?SOD1融合蛋白能以天然活性形式迅速高效的转导入大鼠心肌组织，并保持酶活性达24 h.

【关键词】 细胞穿透肽;PEP?1肽;超氧化物歧化酶

0引言

研究发现，只有高度脂溶性、分子质量不超过600道尔顿的化合物或6个氨基酸残基以下的小肽才能直接透过细胞膜或血脑屏障，这为无特异受体/通道和入胞方式的具有治疗作用的大分子物质有效地发挥功效造成了极大的障碍. PEP?1是Morris等[1]设计的一种新的细胞穿透肽(cell penetrating peptide, CPP)，PEP?1能够把β?半乳糖苷酶(β?galactosidae，β?Gal)，抗体、增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)，人Cu，Zn?SOD等大分子物质以天然活性形式转导入细胞内而不需预变性[2-3]. 铜，锌?超氧化物歧化酶(Cu，Zn?superoxide dismutase;SOD1)是细胞中高水平表达的SOD形式，可以专一性清除超氧阴离子(O2-)，从而防止氧应激损伤[4]. 由于SOD1系大分子物质，在生物体内无特异受体和通道，也不能依靠内吞作用等人胞方式进入细胞内，生物学作用的发挥受到很大的限制. 本研究通过基因工程手段表达和纯化SOD1和PEP?1?SOD1融合蛋白，研究PEP?1?SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性，为临床应用抗氧化酶SOD1治疗氧应激损伤提供依据.

1材料和方法

1.1材料健康雄性SD大鼠72只，体质量(250±20) g，(湖北省实验动物中心);pBluescript Ⅱ SK?SOD1质粒(美国西奈山医学院生物化学/药理学系白景香博士惠赠);pGEM?T easy vector 系统(美国Promega公司);pET15b，E.coli BL21(DE3)(美国Novagen公司);DH5α(郧阳医学院临床医学研究所提供);PEP?1肽DNA序列(北京赛百盛基因技术有限公司);异丙基硫化?β?D?半乳糖苷(isopropy?β?D?thiogalactoside, IPTG)(美国Promega公司);兔抗His?probe(G?18)抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司);小鼠抗心肌TnT抗体，四乙基若丹明异硫氰酸盐(tetraethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC)标记的山羊抗兔二抗、异硫氰酸荧光素(fluoresein isothiocyanate，FITC)标记的山羊抗小鼠二抗(美国KPL公司);4，6?二氨基?2?苯基吲哚(4,6?Diamidino?2?phenylinole, DAPI)(美国Sigma公司);SOD检测试剂盒(南京建成生物工程研究所).

1.2方法

1.2.1SOD1，PEP?1?SOD1融合蛋白的表达、纯化和鉴定将构建的原核表达质粒pET15b?SOD1[5]，pET15b?PEP?1?SOD1[6]分别转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，用IPTG诱导分别表达出SOD1和PEP?1?SOD1 目的蛋白，采用Ni2+?金属螯合亲和柱层析对其进行纯化，对纯化后的蛋白取样，进行SDS?PAGE电泳，将样品蛋白转移到NC膜上，用抗His?tag抗体孵育，采用Western Blot显示分析. 以牛血清白蛋白(1 g/L)做标准对照，采用Bradford法进行蛋白浓度定量.

1.2.2实验动物分组将大鼠随机分为SOD1组和PEP?1?SOD1组. SOD1组经尾静脉注射500 μg纯化后的SOD1;PEP?1?SOD1组经尾静脉注射500 μg纯化后的PEP?1?SOD1融合蛋白. 两组分别于注射后0.5，1，2，4，8，24 h时间点取心脏(n=6，每组，每个时间点).

1.2.3免疫组织化学方法评价PEP?1?SOD1在活体大鼠心肌组织的转导能力SOD1组和PEP?1?SOD1组，于注射后相应时间点迅速取大鼠心脏，切成两半，一半置-80℃冰箱冻存. 另一半经40 g/L多聚甲醛溶液固定6 h后行冰冻切片，PBS漂洗10 min×3，加兔抗His?probe抗体(1∶200)，小鼠抗心肌TnT抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，PBS漂洗10 min×3，加 TRITC标记的山羊抗兔抗体(1∶200)，FITC标记的山羊抗小鼠抗体(1∶200)，室温孵育2 h，PBS漂洗10 min×3，加DAPI湿盒染色15 min，PBS漂洗5 min×3，抗荧光淬灭封片液封片后于倒置荧光显微镜下观察摄像.

1.2.4心肌组织S

OD1活性测定取纯化后的SOD1和PEP?1?SOD1融合蛋白冻存的心肌组织，精确称重，加9倍组织块重量的冷生理盐水，超细匀浆器制备组织匀浆，按SOD检测试剂盒说明书黄嘌呤氧化酶法测定其酶的活性.

统计学处理：计量资料以x±s表示，使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，并结合LSD检验进行两两比较. P<0.05为差异具有统计学意义.

2结果

2.1Western Blot鉴定纯化后的目的蛋白SOD1和PEP?1?SOD1经SDS?PAGE和Western Blot检测，发现分别在Mr约为22×103和26×103处有相应的单一杂交条带(图 1). Bradford法测得SOD1和PEP?1?SOD1融合蛋白的产量分别为158.5 g/L和212.1 g/L.

2.2纯化后的蛋白酶活性黄嘌呤氧化酶法测定纯化后的SOD1和PEP?1?SOD1融合蛋白的SOD1 活性分别为15.87×103U/g和12.23×103U/g.