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作者：李岱容，曹炬，王虹，吴凯峰，尹一兵

【摘要】 目的: 评价酪蛋白裂解酶P(ClpP)作为候选疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎链球菌(SPN)中的表达情况. 方法: 以TIGR4型SPN的ClpP基因序列设计引物，分别以12株不同血清型SPN的基因组DNA为模板，对ClpP基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增、胶回收产物与PMD?18克隆载体连接后进行测序，运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析，并利用Western Blot方法检测12株不同血清型SPN的ClpP蛋白的表达情况. 结果: 12株不同血清型SPN的ClpP基因序列和GenBank数据库对已公布的TIGR4型SPN的ClpP基因一致性>99.0%，推测的氨基酸序列一致性>99.5%. Western Blot结果显示anti?ClpP多克隆抗体与12型SPN的菌体蛋白能够起交叉反应. 结论: ClpP蛋白在不同型SPN之间同源性高，在不同型SPN菌株中均有表达. ClpP是一个具有前景的SPN候选蛋白疫苗因子.

【关键词】 肺炎链球菌;ClpP基因;序列分析;抗原性

0引言

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae，SPN)是引起获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎的主要病原菌. 随着多重耐药菌株的不断发现，疫苗在预防和控制SPN感染中的作用越来越重要[1]. SPN根据荚膜可分为90多个血清型，开发对所有血清型SPN都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前SPN疫苗的发展方向. 研究发现的SPN蛋白质候选疫苗酪蛋白裂解酶P(caseinolytic protease P, ClpP)是ATP依赖的丝氨酸蛋白水解酶[2]，其在SPN的生存、致病和入血过程中起着重要的作用[3-4]，针对其靶点的疫苗或抗生素也越来越显示出其潜在的价值. 本研究探讨ClpP在不同SPN菌株中的保守性与抗原性，以及在不同血清型SPN中表达情况，旨在为自主开发SPN蛋白疫苗奠定基础.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌种与质粒12株不同血清型SPN： CMCC(B)31 109(serotype 1)，CMCC(B)31 203(serotype 3)，CMCC(B)31 446(serotype 4)，CMCC(B)31 011(serotype 5)，CMCC(B)31 207(serotype 6B)，CMCC(B)31 507(serotype 7F)，CMCC(B)31 216 (serotype 9V)，CMCC(B)31 614 (serotype 14)，CMCC(B)31 687(serotype 18C)，CMCC(B)31 693(serotype 19F)，CMCC(B)31 759(serotype 23F)(北京中国医学细菌保藏管理中心)，NCTC7466 (serotype 2，国际通用名为D39)(欧洲国家标准菌种库);大肠杆菌DH5a和原核表达系统(含pET32a(+)/ClpP重组质粒)E.coli BL21(DE3)(重庆医科大学临床检验诊断学重点实验室)，金黄色葡萄球菌标准菌株(重庆医科大学微生物学教研室)，质粒PMD18?T载体试剂盒(日本TaKaRa公司).

1.1.2试剂DNA提取试剂盒，凝胶回收试剂盒及日常型质粒DNA快速制备试剂盒(上海华舜公司);限制性内切酶EcoRI，SacI，高保真LA Taq聚合酶，dNTPs，Buffer，MgCl2(大连宝生物技术公司);丙烯酰胺，双丙烯酰胺，异丙基?β?D?硫代半乳糖苷(IPTG)，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)(美国Sigma公司);DNA marker(上海生工公司);Goat?anti?mouse IgG HRP(H+L)和3?二氨基苯联胺DAB∶3(北京中杉公司);咪唑，Nacl和Tris碱(美国BBI公司);His Bind Column(Ni?NTA)镍柱(美国Novagen公司).

1.1.3仪器热循环仪(TMBio?Rad PCR，美国gene cycle公司); 电泳仪(Power/PAC200，美国Bio?Rad公司).

1.1.4动物BALB/c小鼠，雌性，8~10 wk龄，体质量18~20 g(重庆医科大学实验动物中心).

1.2方法

1.2.1聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因将12株SPN在C+Y培养基中增菌至对数生长中后期，按试剂操作说明书分别提取基因组DNA，扩增ClpP的开放读码框架(591 bp). 上游引物：5′?CGAATTCATGATTCCTGTAGTTAT?3′，含EcoRI位点;下游引物：5′?CGAGCTCTTAGTTCAATGAATTGTTG?3′，含SacI位点，引物由上海生工生物技术公司合成. 使用La Taq高保真DNA聚合酶，以不同型SPN基因组DNA为模板进行扩增. PCR体系: ddH2O 13.7 μL，5×buffer(含Mg2+) 6.0 μL，dNTP(10 mmol/L) 2.4 μL，P1(5 pmol/L) 3 μL，P2(5 pmol/L) 3 μL，SPN DNA 1.5 μL，LA Taq 0.4 μL. 在PCR仪上按下列条件进行扩增：95℃预热5 min后反应30个周期：94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min. 末轮后72℃延伸 5 min. 取5 μL反应产物置10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，DNA胶回收试剂盒回收PCR产物.

1.2.2TA克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的12个PCR产物克隆至PMD?18T载体，转入DH5α感受态细胞，在Amp+LB平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定，并将质粒送往重庆医科大学感染实验室做双向测序.

1.2.3序列比对与氨基酸序列预测利用DNAssist软件，