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浅谈草珊瑚离体不定丛芽诱导因子筛选的研究

作者：潘见欢 潘超美 陈良坚 黄崇才 赖珍珍

【摘要】 【目的】　探讨影响草珊瑚不定芽诱导的培养因素，为建立草珊瑚初代离体培养体系提供依据。【方法】以草珊瑚下胚轴诱导获得的无菌再生苗茎段为外植体，考察6?苄氨基嘌呤(6?BA)和吲哚丁酸(IBA)不同浓度配比、光照时间和强度以及温度对草珊瑚离体不定芽高频诱导的影响。【结果】6?BA和IBA组合能有效提高草珊瑚不定芽的诱导率，而高浓度的植物激素会抑制草珊瑚不定芽的生长;草珊瑚在散射光或弱直射光照射下生长势头好，暗培养或过强直射光会出现植株发黄、皱缩、甚至死亡的现象;在温度为25?℃时，草珊瑚不定芽诱导率达到100?%，低于25?℃或高于30?℃均不利于其生长。【结论】以MS培养基为基本培养基，附加2?5?mg/L 6?BA+ 0?1?mg/L IBA，温度为25?℃，采用柔弱自然散射光或低于?2?000?lx?直射光照射，时间少于8?h能有效促进草珊瑚离体不定芽的诱导，诱导率达82?98?%。?

【关键词】 草珊瑚/生长和发育;　不定丛芽;　培养基，条件性?

草珊瑚?Sarcandra glabra?( Thumb?) Nakai ，属金粟兰科Chloranthaceae 草珊瑚属?Sarcandra?，又叫九节茶、肿节风、接骨木，为多年生草本或亚灌木。草珊瑚具消炎、清热、解毒和舒筋活血作用，临床用于治疗多种炎症。最新研究发现草珊瑚对肿瘤，尤其是急性白血病有一定治疗效果??[1]?。近年来草珊瑚已被开发成一系列药品和日用品，如草珊瑚口服液??[2]?、草珊瑚清口香??[3]?和草珊瑚注射液??[4]?等。随着开发利用的不断扩展， 忽视了对其资源的保护，致使野生资源遭受毁灭性的破坏，因此挽救草珊瑚种质资源的研究势在必行。目前对草珊瑚的研究主要集中在常规栽培、药材的组织鉴别以及化学成分组成的分析上，在离体快速繁殖方面的研究甚少。本文在建立草珊瑚离体快速繁殖培养体系研究的基础上，对草珊瑚的离体丛芽诱导培养进行了多方面考察，旨在为肿节风药材生产的源头——草珊瑚优质种苗(试管苗)繁育的规模化、产业化生产奠定基础。现报道如下。?

1　材料与方法?

1?1　药材　试验药材采自广州帽峰山野生草珊瑚，经广州中医药大学药用植物学教研室潘超美教授鉴定，确认为金粟兰科植物草珊瑚?Sarcandra glabra?(Thumb?)Nakai。取其种子，经消毒后在无菌条件下诱导萌发，切取胚和下胚轴诱导获得无菌丛芽和再生植株，以无菌再生苗的茎段作为诱导不定芽的材料(图1)。

1?2　主要仪器与试剂　6?苄氨基嘌呤(6?BA)由上海求精生化试剂仪器有限公司生产(批号：20060718);吲哚丁酸(IBA)由上海求精生化试剂仪器有限公司生产(批号：20070310);琼脂粉由湛江新台兴海洋生物制品有限公司生产(批号：2007818);其他试剂均为化学纯;DL?CJ?1F型单人双面超净工作台由哈尔滨东联电子技术有限公司提供;YXQ SGD型全自动高压灭菌锅由广东医疗器械厂提供;XS125A型电子分析天平由瑞士Sartorius公司提供。LRH?300?G型生物光照培养箱由广东医疗器械厂提供。表1　丛芽诱导培养基的L??16?(4?5) 正交试验设计

1?3　多种影响因子的筛选??[5]?　采用MS培养基为基本培养基，培养基按照常规方法，根据表1正交试验设计的不同配方配制， 添加30?g/L的蔗糖、?6?g/L?琼脂粉，pH?5?8～6?0，121?℃～124?℃(1?1?kg/cm?2压力)灭菌15?min。在无菌条件下，将草珊瑚无菌再生苗切成1～1?5?cm长带节茎段，接种于培养基中，每瓶3～4个。培养温度(25±2)?℃，光照用日光灯1?800～2?200?lx，每天连续光照8?h。28?d后统计不定芽诱导率及不定芽的增殖率。?

2　结果与分析?

2?1　不同激素配比对草珊瑚丛芽诱导的影响　从表2结果可知，处理10和处理14均能获得较高的不定芽诱导率，即3?mg/L?6?BA+0?1?mg/L?IBA和2?5?mg/L?6?BA+0?1?mg/L?IBA的组合，在此激素组合水平下， 草珊瑚不定芽生长迅速，较粗壮，说明草珊瑚不定芽诱导阶段要求有较高的外源激素水平。但高含量的细胞分裂素(处理13~16)会在不定芽形成后，芽的基部膨大导致材料愈伤化。故不定芽诱导中以处理10组合较为合适。在两种激素的试验处理中，单独使用6?BA的量达3?mg/L(处理13)时，不定芽诱导率可提高到73?68?%，不定芽萌动时间提早，接种后15?d左右就会看到茎节处长出不定丛芽，但芽体较纤弱。?

图2结果显示，虽然6?BA、IBA和诱导率之间无明显线性关系，但在IBA浓度较低 (IBA=0、0?1?mg/L)时，随着6?BA浓度的增加，诱导率基本呈现增加的趋势，当6?BA为2?5?mg/L，IBA为0?1?mg/L时诱导率最高，达到82?98?%。当IBA浓度大于0?1?mg/L时，诱导率的变化波动较大。结合表2的直观分析表明，?R??A为0?219、?R??B为0?226，两种因子对丛芽诱导产生效应是IBA>?6?BA?，6?BA是影响不定丛芽分化的主要因子。

2?2　光照时间和强度对草珊瑚丛芽诱导的影响?

将草珊瑚无菌再生苗茎段接种到试验处理10的培养基中，置于光照培养箱中，温度设定为?25?℃?，考察不同光照时间和强度对草珊瑚丛芽诱导的影响，结果见图3、图4。在光照强度约为?1?800?～2?000?lx的直光培养中， 光照8?h的草珊瑚丛芽生长较快，植株生长迅速、叶片颜色深绿。但随着光照时间的增长，诱导率逐渐下降。此外，自然光照比放在培养箱中直光光照生长更迅速、丛芽诱导更好。而图4结果表明，光照强度对草珊瑚不定芽的生长有很大的影响，每增加2?000?lx，诱导率都降低10?%以上，在强光照下，草珊瑚不定芽生长变缓慢，叶片边缘发黄、皱缩，几乎不萌发出新芽，这一现象与草珊瑚的喜阴习性相符。?表2　不定芽诱导培养基的正交试验结果及直观分析

另外本实验也考察了黑暗中草珊瑚不定芽的生长情况，发现草珊瑚不定芽生长十分缓慢，甚至叶片边缘变黄、脱落，最终死亡，所以暗培养不适合用于草珊瑚茎段不定芽的诱导。?

2?3　温度对草珊瑚丛芽诱导的影响?