严重急性呼吸综合征患者肺组织包被抗原的特异性研究，目的在于同时检测SARS患者及正常献血员血清中的IgG。

:探讨严重急性呼吸综合征(SARS)肺组织包被抗原在不同个体以及猪、羊、大鼠中的种属特异性。方法:匀浆SARS患者尸检肺组织、非SARS患者肺组织以及猪、羊、大鼠肺组织后分别包被,利用酶联免疫吸附试验(ELISA),同时检测SARS患者及正常献血员血清中的IgG。结果:SARS患者及正常献血员血清用SARS尸检患者与非SARS患者肺组织包被抗原检测,两种组织包被抗原检测的阳性率间无统计学差异;而用非SARS患者肺组织包被抗原检测的阳性率和用羊、猪、大鼠肺组织包被抗原检测的阳性率均具有统计学差异。结论:SARS患者肺组织及非SARS患者肺组织中存在相同的抗原;其他动物中可能也存在该抗原,但可能因为其他抗原干扰而不适于用该方法检测。

① 严重急性呼吸综合征(SARS),又称为传染性非典型肺炎,具有急性发病、早期出现肺部病变、病死率高等特点,已经成为严重危害人类健康的世界性问题。已有相关报道分离了衣原体、副黏液病毒、冠状病毒,而且目前已确认其致病原为新型冠状病毒[1~3]。基于患者血清中存在病原体特异性抗体的假设,我们对SARS患者恢复期血清进行了一系列研究,发现血清中存在着抗肺组织的相关抗体,并且建立了早期的诊断方法[4,5]。本研究进一步应用不同人(SARS死亡患者肺组织及1例非SARS患者肺组织)及猪、羊、大鼠肺组织,制备匀浆处理后包被,应用ELISA方法检测SARS患者血清中的抗肺组织抗体,以求阐明肺组织中相关抗原的特异性。

1 材料和方法

1.1 材料 血清标本:选取302医院临床诊断SARS患者血清11份,307医院血站筛查的献血员血清12份。肺组织:SARS患者肺组织1例取自302医院SARS死亡患者尸检标本,非SARS患者肺组织取自301医院手术切除的肺组织标本,猪、羊肺组织购自市场,大鼠肺组织源于302医院动物中心麻醉处死后解剖的肺组织。以上组织均于-80℃保存。Hitrap-Protein G,购自Amersham Pharmacia Bio-science公司。1.2 方法1.2.1 肺组织匀浆包被液的制备 取冰冻肺组织后,加入裂解液(Tris-HCl,Aprotinit,PMSF,SDS等组成),加入适量多份献血员混合血清4℃孵育过夜,4℃10 000×g离心10 min,取上清,用0.5mol/L Na2HPO4(pH 8.0)缓冲液稀释后,按说明书操作上柱,利用Hitrap-Protein G本 论文 出自 无忧论文网去除肺组织及加入的献血员血清中混杂的人IgG,收集过柱液检测280 nm处光密度值(D280),计算蛋白含量备用。SARS患者尸检肺组织、非SARS患者肺组织及动物肺组织均按如上方法制备包被液。1.2.2 ELISA检测 将上述包被液用50 mmol/L碳酸盐缓冲液稀释,1 mg/ml包被聚丙乙烯微孔条,4℃过夜;加120μl FCS-PBS 37℃封闭2 h;依次加入SARS患者及献血员血清(1∶10稀释),37℃孵育1 h;加入HRP-羊抗人IgG(1∶1 000),孵育同上;最后加入TMB显色液显色15 min,于450 nm波长下检测光密度值(D450)。结果判定:(样品D450-本底)/(对照D450-本底)>2.1为阳性。应用SAS软件对结果进行统计学分析。

2 结 果

2.1 SARS患者肺组织及非SARS肺组织包被抗原的特异性比较 我们选取了11份SARS患者血清及12份献血员血清对肺组织包被抗原进行ELISA检测,其结果见表1。统计学分析结果表明,SARS患者肺组织与非SARS肺组织包被抗原检测的阳性率(47.8%vs60.9%)间差异不具统计学意义。

2.2 非SARS肺组织与猪、羊、大鼠肺组织包被抗原的特异性比较 选取了5份SARS患者血清及10份献血员血清,分别用非SARS肺组织及猪、羊、大鼠肺组织包被抗原进行ELISA检测,结果见表2~4。统计学分析结果表明,非SARS肺组织与猪、羊、大鼠肺组织包被抗原检测的阳性率差异均具统计学意义。

3 讨 论

我们先前的研究工作已经表明SARS患者会产生针对肺组织的自身相关抗体,同时通过多次实验,非SARS患者肺组织吸附阳性患者血清后,该血清与患者肺组织的结合反应被阻断[4],说明该抗体是针对肺组织细胞中的某种或某些成分。基于以上结果我们设计了此次研究,力求阐明SARS患者血清中存在的相关抗体所针对的抗原是否存在个体差异及种属特异性。为此,选取了SARS患者尸检肺组织、非SARS(肺癌)患者手术切除的肺组织以及猪、羊、大鼠肺组织,经匀浆、献血员血清吸附、去除IgG后定量蛋白,同时以1 mg/ml包被,检测同样的血清。结果经统计分析,发现SARS患者肺组织与非SARS患者肺组织包被抗原检测的阳性率间不存在差异,因此认为我们检测的SARS相关抗体是广泛的针对肺组织的,并且个体差异不大(但是否存在民族、生活环境等因素的影响,仍需进一步研究);基于SARS患者肺组织与非SARS患者肺组织间检测阳性率不存在差异,我们在研究种属特异性时应用非SARS患者肺组织包被,结果显示猪、羊、大鼠肺组织间阳性率差异均具统计学意义,这说明该抗原存在着可能的种属特异性,或者该抗原含量在不同种属间存在差异,或者由于种属差异,其他抗原、抗体含量较高影响了特异的相关抗原、抗体反应,其确切的机制有待深入的研究。SARS的病原虽已确定,但其发病机制仍需进一步探讨。临床表现病程发展迅速,肺部体征严重,我们的研究提示病原的感染可能导致机体产生此种自身抗体,引发异常免疫病理损伤并因此而加重病情。目前WHO推荐的SARS治疗方案中,鼓励使用大剂量的皮质激素,并且激素在临床的实际应用中有较好的疗效。而这与以往临床治疗传统流行性感染性疾病的基本原则不一致,我们推测激素的可能作用是抑制自身的异常免疫反应。另外针对自身抗体,我们也进行了检测(包括抗肝肾微粒体、抗肝可溶性抗原抗体、抗平滑肌抗体、抗胃壁细胞抗体、抗甲状腺抗体、抗线粒体抗体及抗核抗体等),结果提示我们实验发现的SARS相关抗体不属于已知的自身抗体类。我们在对临床SARS患者血清中抗肺特异性抗体的动态研究中也发现患者血清中可以最早在发病后2 d检测到该抗体,在肺部出现X线可见阴影前检测到较高滴度抗肺抗体,而且与激本 论文 出自 无忧论文网素治疗效果,以及病情严重程度有一定相关性[6]。这些现象都提示这些肺组织特异性抗体参与了SARS感染对患者肺部的损伤作用。对抗肺组织抗体在SARS致病中作用的研究,对于SARS感染的早期诊断,以及指导SARS感染的临床治疗都有一定的意义。

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