戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体的鉴定：戊型肝炎(戊肝)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的一种胃肠道传播的急性肝炎,约占我国散发性肝炎中的15%~20%。

阻断实验发现,用戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白重组抗原制备的8株抗HEV单克隆抗体(mAb),分别识别3个构象表位和2个线性表位。用抗体捕获反转录PCR方法证实,其中识别2个构象表位的3个mAb可以直接捕获HEV颗粒,表明这2个表位位于HEV颗粒的外表面。识别这两个表位的mAb8C11和8H3均可中和HEV对恒河猴的致病性和感染性。mAb8C11缩短排毒时间的效应较明显,而mAb8H3延迟机体抗HEV抗体阳转时间的效应较明显。二者的中和效应具有较明显的协同作用。中和单抗8C11、8H3对戊肝不同感染时期的血清均有显著阻断作用,Fab片段的阻断作用与完整抗体类似,表明这两个mAb对应的中和表位是HEV体液免疫应答的优势表位。

戊型肝炎(戊肝)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的一种胃肠道传播的急性肝炎,约占我国散发性肝炎中的15%~20%,且时有爆发或流行的报道[1]。HEV大小约27nm~34nm(平均30nm~32nm),为单股正链无包膜的RNA病毒,其归类尚未确定。HEV基因组包含3个开放读码框架(ORF),其中ORF2编码病毒结构蛋白,组成病毒衣壳,也是主要的免疫优势蛋白。目前已发现多个ORF2重组蛋白具有免疫保护作用,表明ORF2蛋白上存在着重要的中和表位[2]。由于中和性单克隆抗体(mAb)对戊肝疫苗、诊断试剂、感染机制等基础与应用研究的重要作用,戊肝中和mAb的分离一直是戊肝研究的重点之一。但由于戊肝细胞模型的缺乏,这一研究的进展十分缓慢。目前报道的唯一的一个戊肝中和mAb,是由Schofield等[3]利用噬菌体抗体文库技术从黑猩猩外周血淋巴细胞中分离鉴定出的。最近,我们在大肠杆菌中表达了HEVORF2的一个片段,获得的重组蛋白(NE2)可自发形成以二聚体为基础的多种聚合形式,类似于病毒衣壳蛋白的装配过程[4,5]。NE2蛋白二聚体及多聚体对戊肝急性期、恢复期血清均有较单体蛋白强许多的反应性,免疫恒河猴可产生良好的保护性,NE2免疫多抗可以完全中和HEV对恒河猴的感染性。这些结果均表明,NE2蛋白较好地模拟了HEV病毒衣壳蛋白的天然立体结构,并正确形成了重要的中和表位[4-7]。本研究中,我们从E2蛋白制备出的多株mAb中成功鉴定出两株中和mAb,分别识别HEV ORF2上的两个不同表位区域,从而首次证实:HEV ORF2上至少存在2个不同的中和表位区域,并为HEV疫苗、诊断、病毒感染机制等相关研究提供了重要的工具。

材料与方法

1　HEV ORF2重组蛋白NE2及抗HEV mAb的制备　HEVORF2区重组蛋白NE2及由NE2免疫筛选出的抗HEVmAb,均由本实验室制备,具体方法参见文献[5,8]。

2　抗HEV mAb与NE2的蛋白印迹试验(Western blotting)　8株抗HEV mAb(1F6、2C9、7E8、8H3、8C11、13D8、15B2和16D7)分别与NE2蛋白及沸水浴10min后的NE2蛋白,按文献方法进行蛋白印迹试验[5]。

3　抗HEV mAb间的相互阻断试验　以改良过碘酸钠法标记各mAb,用ELISA法进行相互阻断试验。取每孔0.05μg/mlNE2包被的ELISA板,分为8组,每组分别加入100μl/孔的不同单抗(分别以20%小牛血清PBS稀释至ELISA滴度为1∶105),另外1个孔中仅加入20%小牛血清PBS作为对照。37℃孵育30min,吸弃液体,在8组孔中分别加入100μl/孔的8种不同的HRP标记的单抗(以20%小牛血清PBS稀释至1∶103ELISA滴度),37℃孵育30min;用PBST洗涤5次并扣干后,加入显色剂,37℃温育15min,2mol/L硫酸50μl终止反应。于酶标仪上读取OD450/620nm的值,计算阻断率(阻断率=1-阻断孔OD值/对照孔OD值),阻断率大于50%判断为有阻断。

4　抗体捕获HEV反转录PCR(RT- PCR)　紫外照射1•5ml Epplendorf管30min,分别加入500μl以碳酸包被缓冲液(pH为9.5)1∶1 000稀释的8本 论文 出自 无忧论文网种不同mAb,以空白包被液、抗HBs mAb为阴性对照,兔抗NE2为阳性对照。37℃包被过夜,吸去包被液,加入1.5ml封闭液(含2%的白蛋白的PBS,pH7.4),37℃封闭2h;吸去封闭液,加入500μl以无菌生理盐水稀释的HEV病毒阳性粪便10%悬液,37℃反应2h,PBST洗涤6遍;加入250μl ddH2O,按文献进行RT-PCR检测[7]。

5　恒河猴HEV感染中和试验　实验用猴由广西疾病预防控制中心提供。实验前进行常规医学观察,并持续2周检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平,攻毒前检测抗HEV抗体均为阴性,实验期间分笼喂养。12只恒河猴分为4组,每组3只,第1组为对照组(猴KF25~27),第2组为8C11 mAb中和组(猴KF16~18),第3组为8H3 mAb中和组(猴KF19~21),第4组为混合mAb组(8C11、8H3 mAb等量混合)(猴KF22~24)。HEV阳性粪便稀释至103PCR滴度,各取2ml分别与2ml的mAb稀释液、mAb8C11腹水(滴度1∶105)、mAb8H3腹水(滴度约为1∶104),或8C11和8H3等体积混合腹水混匀,4℃过夜(约14h),室温孵育2h。每种病毒-腹水混合物分别静脉感染3只恒河猴(每只1ml)。从攻毒当天起每日收集粪便至第2周,随后每周2次收集粪便,以RT-PCR检测粪便中HEV RNA。从攻毒起每周收集血清,检测ALT和抗HEVIgG抗体。抗HEVIgG抗体检测使用NE2抗原(参见文献[9]。以粪便出现排毒或抗体出现阳转作为HEV感染成功指标。

6　抗HEV mAb对抗HEV多抗血清的阻断试验　抗HEV多抗血清包括3份戊肝患者急性期血清、3份戊肝恢复期抗HEVIgG阳性血清以及3只HEV实验感染猴系列血清。取NE2包被并封闭好的ELISA板,分别加入100μl浓度为1mg/ml的不同抗HEVmAb,以血清稀释液为未阻断对照。37℃孵育30min,甩干,加入对比稀释的待检血清,37℃孵育30min,PBST洗涤5次,扣干后每孔加入100μl稀释好的抗人IgG-HRP,37℃温育30min;洗涤5次,扣干,加入显色剂,37℃温育10min, 2mol/L硫酸50μl终止反应,读取OD450/620nm。以未阻断孔OD值在1.0~1.5之间的稀释度计算阻断率,阻断率=(1-阻断孔OD/未阻断孔OD)×100%,阻断率>50%为阳性。

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