3.Western印迹法:细胞在10cm培养皿(Corning,美国)中生长融合约90%时,PBS清洗2次后加入300μLRIPA,置冰上30min裂解充分后煮沸10min,随后13000r/min离心5min。取上清液,BCA法测定蛋白质浓度。每孔上样量100μg,加入5×上样缓冲液、去离子水至总体积一致后变性电泳(积层胶80V,分离胶120V),半干转法转膜(15V)70min后脱脂牛奶室温封闭2h,4℃下一抗(兔抗人TMPRSS4多抗,112831-AP,Proteintech,美国,1∶600稀释)孵育过夜。TBST洗膜3遍后加入一定比例稀释的相应二抗室温孵育1h,TBST洗膜2次,PBS洗膜1次后荧光发光显色。
    4.siRNA瞬时转染:细胞生长至70%融合时胰酶消化,计数后按每孔3×105细胞铺6孔板,过夜。24h后按照Lipofectamine2000(Invitrogen,美国)说明书操作进行细胞转染。由上海吉玛生物有限公司设计并合成TMRPSS4-siRNA序列:5′-AAGUUGUCGAAACAGGCAGAGAACC-3′(si组)。仅转染Lipo2000的细胞为空白对照组,转染阴性对照序列的细胞为阴性对照组(NC组)。转染48h后用Trizol试剂提取细胞总RNA,72h提取总蛋白质。
    5.CCK-8测细胞增殖:取转染后SW480细胞计数后铺于96孔板,每孔100个;设干扰组、阴性对照组和空白对照组,每组6个复孔。在第0、24、48、72、96和120h,分别于各孔加入CCK-8试剂(cellcountingkit-8,Dojindo,日本)10μL,37℃孵育2.5h,酶标仪测定各孔在450nm的吸光度值。以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
    6.AnnexinⅤ/PI流式检测细胞凋亡:转染48h后收细胞,取100μL细胞悬液(1×106个/mL)至流式管,用PBS洗涤1次,离心后加入300μL结合缓冲液,混匀,再加入5μL的AnnexinⅤ-FITC和5μL的PI,孵育15min后用流式细胞仪(BD,美国)上机检测。
    7.划痕试验:6孔板转染,待细胞铺满后,用无菌枪头每孔笔直划线,PBS清洗3次,加入无血清培养液置培养箱孵育。24h后在显微镜下每孔随机选取视野观察摄片。
    8.transwell迁移试验:取转染24h后细胞,无血清RPMI1640培养液重悬后计数,调至终密度为5×105个/mL。24孔板每孔内加入900μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,随后置入transwell小室(Corning,美国),小室内加入200μL细胞悬液(105个细胞)。培养箱孵育24h后取出,棉签拭去内室面细胞,甲醇固定小室外穿出细胞10min,1%结晶紫染色10min,PBS清洗3遍后,显微镜下观察摄片。
    三、统计学方法
    采用SPSS11.0软件进行统计学分析,计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
    1.免疫组化检测TMPRSS4蛋白在结肠直肠癌组织和正常肠上皮中表达标本免疫组化染色显示,TMPRSS4蛋白定位于细胞膜上,在肿瘤组织和转移淋巴结中均染色阳性,且转移淋巴结中TMPRSS4蛋白染色更强。表明TMPRSS4表达可能与肿瘤细胞迁移能力有一定相关性。
    2.半定量RT-PCR和Western印迹检测TMPRSS4在结肠癌细胞株中的表达通过半定量RT-PCR检测发现,TMPRSS4基因在7株结肠癌细胞中有不同程度的表达,其中在HT29、SW480、SW620、SW1116中的表达相对较高。Western印迹检测亦有类似结果,有细胞均不同程度表达TMPRSS4蛋白,而HCT116、SW480和SW1116蛋白表达量相对较高。因此,本研究决定选用SW480细胞进行下一步试验。三、siRNA瞬时转染后SW480细胞中TMPRSS4蛋白表达下调在转染siRNA48h后,Western印迹法检测发现,与空白对照组和NC组相比,siRNA干扰组(si组)的TMPRSS4蛋白表达明显下降。
    3.TMPRSS4下调可显着抑制SW480细胞的增殖能力siRNA处理SW480细胞株后,采用CCK-8法测定细胞增殖能力。在第1、2、3、4、5天不同时间点分别测定吸光度值,吸光度值可间接反映细胞增殖能力的强弱。与空白对照组和NC组相比,si组细胞增殖能力在48~96h时受到明显抑制(P<0.05)。