2.1 材料与方法

斑马鱼(Danio rerio)，由山东师范大学生命科学学院繁育，斑马鱼成体长(3.0±0.2) cm，体重( 0.3±0.05) g，培养方式为流水培养，水温： 26±2 ℃，光照周期为 16 h(明)：8 h(暗)，早晚定时投喂干饲料 2 次，并清除排泄物。本实验采用体长 3.0±0.2 cm 的健康斑马鱼，采用随机取样法取样。分别选用了有机磷类农药马拉硫磷(纯度 99%)、氨基甲酸酯类农药灭多威(纯度 99%)和拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯(纯度 98.2%)作为试验药物，药品标准样均购于中国标准样品中心。马拉硫磷直接溶于 pH 5.0 的去离子水中，灭多威溶于 pH 7.0 的去离子水中，溴氰菊酯溶于≤0.5%总水体积的二甲基亚砜(DMSO)中，pH 7.0。

2.2 结果与分析

从 3 种农药对斑马鱼的急性毒性来看，斑马鱼对不同农药有不同的耐受性。其中，马拉硫磷和溴氰菊酯对于斑马鱼属于剧毒性毒物，而灭多威对于斑马鱼属于中等毒性毒物。不同农药对斑马鱼毒性大小的不同，可能是因为不同农药的毒性机理不同。有机磷类农药马拉硫磷和氨基甲酸酯类农药灭多威的主要致毒机理都是通过与生物体内的胆碱酯酶结合形成磷酸化的胆碱酯酶，从而抑制胆碱酯酶催化胆碱的水解过程，导致乙酰胆碱等信号分子的代谢紊乱，并使得 mAChR 和 nAChR 发生自适应改变，从而产生神经中毒;区别在于马拉硫磷与胆碱酯酶结合形成的磷酸化复合物非常稳定且不可逆，马拉硫磷还可以直接抑制 mAChR 和 nAChR 的活性，而灭多威与胆碱酯酶的结合反应是可逆的[68]。拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯作为一种高毒性的杀虫剂[69]，主要通过干扰突触膜上的 Na+通道，使神经系统的传导失常，从而产生强烈的毒害作用[70]。在急性毒性实验期间，对照组的斑马鱼运动正常，实验组的斑马鱼由于受药物的毒性作用而出现游动幅度变大、呼吸加快、腮部变红、排泄物变多等神经兴奋行为，这可能是斑马鱼产生的一种回避行为反应[71]。

3 马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯对斑马鱼毒蕈碱型乙酰胆碱受体的影响...........................19

3.1 实验................19

3.2 材料与方法......................................19

3.2.1 药品器材................................19

4 马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯对斑马鱼烟碱型乙酰胆碱受体活性的影响.......................28

4.1 实验目的.....................................28

4.2 材料与方法........................28

5 结论................................................35

4 马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯对斑马鱼烟碱型乙酰胆碱受体活性的影响

4.1 实验目的

分别设定 0.5 TU、1 TU、2 TU 和对照组，研究不同污染物对斑马鱼 N 型受体的影响，以分子水平研究不同农药对斑马鱼胆碱能系统的影响。

4.2 材料与方法

马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯，购于国家标准样品中心;牛血清蛋白(BSA)、考马斯亮蓝，SBH-Bio 公司;二甲基亚砜(DMSO)，Biosharp 公司;NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、乙醇，分析纯，国药集团;斑马鱼烟碱型乙酰胆碱受体酶联免疫分析(Elisa)试剂盒。超声波破碎仪，BILON-650Y，上海比朗仪器有限公司;酶标仪、高速离心机、分光光度计、恒温干燥机、电子天平、恒温水浴锅等。将斑马鱼暴露于 0 TU、0.5 TU、1 TU 和 2 TU 的不同农药中，每 1 h 取样 1 次，连续取样 12 h 或至斑马鱼全部死亡。如果实验组中每 1 h 内有斑马鱼死亡，则另外取样。样品分别装入 EP 管，于-80 ℃冰箱中保存

将-80 ℃冰箱中的样品，加入 9 倍体积的预冷的 PBS(0.1 M，pH 7.2)，迅速用超声波破碎仪破碎，破碎完成后装入离心管，在 4 ℃、2,500 rpm/min 下离心 25 min，取上清液作为粗蛋白液。以 BSA 为参照，通过 Bradford 法[72-74]测定蛋白含量，将蛋白液浓度确定为 0.5mg/ml。具体测量方法见表 3-1。

用双抗体夹心法测定斑马鱼体内nAChR 的活性。用纯化的 nAChR 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 nAChR 标准品和样品蛋白。辣根过氧化物酶(HRP)标记的 nAChR 抗体结合，并形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加HPR 底物四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB 在 HRP 的催化下转化成蓝色，并在酸性作用下转化成黄色，颜色的深浅与样品中 nAChR 的浓度呈正相关。

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