1.4 统计学方法 使用SPSS10.0软件，采用t检验及方差分析。　　

2 结果　　

2.1 显微照相结果 荧光显微镜下观察凋亡细胞，可见核浓缩、核碎裂及凋亡小体等凋亡细胞形态特征。光学显微镜下可见96h肝脏组织散在单个凋亡细胞，且数量较多，对照组光学显微镜下偶见1～4个凋亡细胞。　　

2.2 原位缺口末端标记(TUNEL)法检测结果 实验组TUNEL阳性细胞主要为肝静脉周围区域和门静脉周围区域。而对照组有少量TUNEL阳性细胞，主要位于门静脉周围区域。实验组肝细胞凋亡率24 h为15.2%，96h为20.4%，7天为11.3%，对照组分别为3.5%、4.5%和4%。方差分析显示组间差异有显著性(P<0.01)，组间两两比较差异均有显著性(P<0.01)。表明肝细胞凋亡在使用可卡因早期24h出现，96h达高峰。　　

2.3 流式细胞仪检测结果 流式细胞仪(FCM)分析的细胞分布直方图显示，正常肝组织细胞主要由2 类细胞组成，按DNA含量排列在相应的峰道数内，故可见如下三个峰。第1个峰为2C峰(二倍体量DNA的细胞群)。FCM分析显示对照组分布直方图均以2C峰为主，其次为4C峰。在2C峰之前几乎没有明显的细胞分布(图1)。而实验组大鼠肝细胞分布直方图则为显著改变。在2C峰之前出现一个明显的峰，为断裂的DNA，代表了凋亡细胞数量(图2)。为亚二倍体的DNA，并且数量随用药时间不同而变化(见表1)。 表1 分析实验组和对照组中凋亡细胞 (略) 注:P<0.01，t检验，同对照组相比较(n表标本数)

3 讨论　　

许多研究表明肝脏疾病中都产生肝细胞凋亡，比如急、慢性肝炎，酒精性肝脏疾病和原发性胆汁淤积性肝硬化。已有报道凋亡在肝脏细胞死亡过程中担当重要角色。　　可卡因是一种天然生物碱，可诱导某些动物肝小叶细胞凋亡。在提高可卡因氧化代谢作用的环境下肝脏损伤的肝窦内分布和损伤范围可发生改变[1] 。可卡因肝脏毒性的这种特点似乎在鼠和人类中非常普遍 [1，2] 。由于对人类肝脏的研究受到严格的限制，阐明可卡因对实验动物肝脏毒性的发生机 制就成为研究的热点。我们通过原位缺口末端标记及流式细胞技术对可卡因诱导肝细胞凋亡进行研究。图1 96h对照组大鼠肝组织仅少量不明显亚单倍体DNA 图2 96h实验组大鼠肝组织中亚单倍体DNA明显增多观察形态学变化是分析细胞凋亡的一个重要方法，我们在我们在荧光显微镜下观察到实验组凋亡细胞核的变化，包括核浓缩，核碎裂，核致密及凋亡小体。而对照组很少有这些变化。我们还用TUNEL法检测凋亡。TUNEL法是Gaviel等1992年根据细胞凋亡时DNA断裂的特征而设计的DNA链断端标记技术。它是在末端脱氧核苷酸转移酶的介导下，将生物素化的尿苷三磷酸与DNA链断端结合形成多聚体，再用单克隆抗生物体5多聚体结合。这种结合反应是特异的，能准确反映DNA断裂的存在，能在单个细胞内观察DNA断端，细胞凋亡发生很早期即可用此方法检测出来 [3，4] 。我们通过UNEL法证明，腹腔内注射可卡因，可导致肝细胞凋亡。用药24h出现凋亡，96h达高峰，7天仍存在凋亡。流式细胞计数仪可用于评价在凋亡过程中细胞浆失水，核染色质浓缩及减少。它可在几分钟内就个体细胞及数千个不等的细胞中得到有价值的数值。这项研究分析使用可卡因与对照组相比较其肝细胞明显凋亡，进一步证明可卡因可导致肝细胞凋亡。通过上述证明腹腔内注射可卡因可以导致肝细胞凋亡，凋亡可能归因于可卡因本身和(或)其代谢产物。已经证实的是活性氧(ROS)产生于可卡因代谢期间及由可卡因引起的复灌注的损害期间[5] 。近几年报道ROS可激活细胞凋亡 [6，7] 。