小编又与大家见面了，今天为大家带来的内容是对抗生素抗性与耐药性关系综述，希望可以帮你们解决问题!

实验方法

取该菌液1mL入灭菌平皿中,将融化的MH固体培养基(牛肉膏6.25g/L;酪蛋白胨17.5g/L;可溶性淀粉1.5g/L;琼脂1.3%;pH7.2±0.2,)约20mL倒入平皿,混匀。待培养基凝固后,室温放置3~5min,用镊子将药敏纸片贴放在平皿上,轻压使紧贴琼脂表面,静置5min,置于37℃培养箱内,恒温培养16~18h。量取抑菌圈直径,并记录结果。以标准敏感菌株大肠杆菌ATCC25922为质控菌,操作同上。受试菌株对多种抗生素的敏感性参照国际现行的临床实验室标准化协会CLSI制定的《抗菌药物敏感性实验执行标准》第十九版信息增刊提供的纸片法标准进行判定(见表2)[10]。质粒提取及检测取培养过夜的菌液10mL于离心管中,10000r/min离心5min,弃去上清,向沉淀中加入10mg/mL溶菌酶(以pH8.0,10mmol/L的Tris-HCl配制)500μL,摇匀,37℃水浴45min。采用质粒提取试剂盒,对待测菌株质粒进行提取,并进行1%的琼脂糖凝胶电泳,以λHindⅢ为标准分子量Marker。质粒消除SDS法将待测菌株以2%的接种量接至含有不同浓度SDS的灭菌MRS培养基中(SDS浓度分别为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%)[11],37℃恒温培养12代,每代24h,以质粒消除前菌株为对照,分别进行质粒提取,并对消除后的菌株进行抗生素敏感性检测。SDS-高温法将待测菌株以2%的接种量接至含有不同浓度SDS的灭菌MRS培养基中(SDS浓度分别为0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%),37℃恒温培养24h,再以2%的接种量转入灭菌MRS培养基中,42℃恒温培养24h,此为一个循环[12],重复2~3次,以质粒消除前菌株为对照,分别进行质粒提取,并对消除后的菌株进行抗生素敏感性检测。抗性基因的检测在NCBI中查到质粒上的β-内酰胺类抗性基因blr、ECP-1569、nps-1,以及氯霉素抗性基因cmlA、cat、cmlA1,在Genbank中下载其全序列,设计引物,序列见表3,委托三博远志公司合成。度退火30s,72℃延伸1min,34次循环,72℃延伸10min。反应产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳(80~120V,30min),观察产物电泳带及其位置,按照100bpLadderMarker确定扩增产物的大小。委托宝生物工程(大连)有限公司对PCR产物进行回收、测序。

结果与分析

瑞士乳杆菌LLB的电泳图仅显示一条10kb左右的质粒DNA条带。乳酸菌中普遍存在着质粒,至少25种乳杆菌具有固有质粒,而且一种菌有多个质粒,质粒大小一般在1.9~84.8kb,绝大多数的质粒小于20kb[13]。Gevers等(2003)对风干香肠中的乳杆菌进行检测,发现这些乳杆菌均具有10kb左右的质粒,且在这些质粒上携带了四环素耐药基因tetM[14]。在细菌的传代过程中,某些质粒可能会从细胞中消失,但大多数的质粒是稳定存在的。本研究也对传代30代后上述乳杆菌菌株的质粒进行了检测,结果证明了其质粒的稳定性。质粒消除耐药质粒的存在是细菌耐药性的一个主要原因,因此质粒消除是耐药性消除的一种重要方法。质粒消除便于观察比较消除前后菌体表型的变化,从而得出质粒的遗传功能,在对于质粒所含基因的研究中具有重要意义。SDS法消除质粒消除前后的质粒变化采用浓度为0.05%~0.25%的SDS分别处理供试菌株,在SDS浓度为0.15%、0.2%和0.25%时,上述菌株均不能存活;浓度为0.1%时戊糖乳杆菌Lp-A和植物乳杆菌L11不能存活。因此选择SDS处理后存活的菌株进行质粒检测。结果表明,SDS浓度为0.05%时,植物乳杆菌L11的四条质粒(在1~10kb不等)被完全消除,戊糖乳杆菌CH8的质粒没有被消除。当SDS浓度增加到0.1%时,戊糖乳杆菌CH8的6条质粒丢失了5条,包括一条大于23kb的质粒及2kb到10kb间大小不等的4条质粒,一条15kb左右的质粒没有被消除。而嗜酸乳杆菌LL、戊糖乳杆菌Lp-A和瑞士乳杆菌LLB的质粒均未被消除。由此可见,用SDS消除乳杆菌质粒的效果不显着,与之前的相关报道不相符[15]。消除质粒后菌株抗生素敏感性的变化采用K-B药敏纸片法检测质粒消除后的CH8和L11菌株对抗生素的敏感性。戊糖乳杆菌CH8质粒消除前后,其抗生素敏感性发生了部分变化。质粒消除前,CH8菌株对氯霉素和头孢噻吩均表现出抗性,而消除后对这两种抗生素均表现出敏感,对其他11种抗生素的敏感性没有变化。可见,消除的质粒上可能含有抗氯霉素和头孢噻吩的抗性基因。而植物乳杆菌L11消除了全部质粒后,与消除前相比,其抗生素敏感性没有变化,这也初步表明,植物乳杆菌L11的质粒上不含有所试抗生素的抗性基因,或者在质粒和基因组上同时含有所试抗生素的抗性基因。SDS-高温法消除质粒消除前后的质粒变化采用浓度0.01%~0.03%的SDS分别处理供试菌株,并进行高温培养。在SDS浓度为0.01%、0.015%和0.02%时,上述乳杆菌均存活,但只有CH8的质粒被部分消除,且消除效果并不随浓度的增加而改变,浓度为0.025%、0.03%时,CH8和部分菌株不能存活,仍具有存活能力的菌株,其消除效果不随SDS浓度的增加而改善。因此选择SDS-高温处理后存活菌株进行质粒检测,结果如图7~图11所示。结果表明,嗜酸乳杆菌LL、戊糖乳杆菌Lp-A、瑞士乳杆菌LLB和植物乳杆菌L11在SDS-高温处理后质粒并没有被消除,而戊糖乳杆菌CH8的6条质粒中丢失了5条,被部分消除。

结论

以大肠杆菌ATCC25922为质控菌株,对5株潜在益生乳杆菌的抗生素敏感性研究表明,菌株均对万古霉素、多粘菌素B、杆菌肽、链霉素、卡那霉素、庆大霉素以及萘啶酸表现出普遍的抗性,耐药率达100%。无论采用SDS还是SDS-高温法消除质粒方法,仅对部分菌株中的某些质粒有效,即不同菌株之间,对于不同的质粒其消除方法的有效性存在着差异。对消除质粒后的戊糖乳杆菌CH8抗生素敏感性的分析表明,CH8菌株的质粒上存在决定其头孢噻吩抗性的基因blr,这在一定程度上反映出益生乳杆菌质粒抗生素抗性基因与其耐药性间存在相关性。

小编为您准备的对抗生素抗性与耐药性关系综述，希望可以帮到您！

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