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在手术过程中，虽然器械和物品都已灭菌、消毒，手术人员也已洗手、消毒、穿戴无菌手术衣和手套，手术区又已消毒和铺覆无菌布单，为手术提供了一个无菌操作环境。但是，在手术进行中，如果没有一定的规章来保持这种无菌环境，则已经灭菌和消毒的物品或手术区域仍有受到污染，引起伤口感染的可能，有时可能使手术失败，甚至影响病人的生命。这个所有参加手术的人员必须认真执行的规章，即称无菌操作规则，如发现有人违反时，必须立刻纠正。无菌操作规则包括：
1.手术人员一经“洗手”，手臂即不准再接触未经消毒的物品。穿无菌手术衣和戴无菌手套后，背部、腰部以下和肩部以上都应认为是有菌地带，不能接触；同样，手术台边缘以下的布单，也不要接触。
2.不可在手术人员的背后传递器械及手术用品。坠落到无菌巾或手术台边以外的器械物品，不准拾回再用。
3.手术中如手套破损或接触到有菌地方，应另换无菌手套。前臂或肘部碰触有菌地方，应更换无菌手术衣或加套无菌袖套。无菌巾、布单等物，如已被湿透，其无菌隔离作用不再完整，应加盖干的无菌单。
4.在手术过程中，同侧手术人员如需调换位置时，应先退后一步，转过身，背对背地转到另一位置，以防止污染。
5.手术开始前要清点器械、敷料，手术结束时，检查胸、腹等体腔，核对器械、敷料数无误后，才能关闭切口，以免异物遗留腔内，产和严重后果。
6.切口边缘应以大纱布垫或手术巾遮盖，并用巾钳或缝线固定，仅显露手术切口。
7.作皮肤切口以及缝合皮肤之前，需用70%酒精或0.1%新洁尔灭溶液，再涂擦消毒皮肤一次。
8.切开空腔脏器前，要先用纱布垫保护周围组织，以防止或减少污染。
9.参观手术人员不可太靠近手术人员或站得太高，也不可经常在室内走动，以减少污染的机会。