供试黑斑病菌种(BHB)采自湖北省农业科学院蔬菜科技中心试验基地。菌种接种前用PDA碳源减半(马铃薯200 g，葡萄糖/蔗糖5 g，琼脂15 g，pH 7.0，去离子水1 000 mL) 固体培养基进行培养。

供试大白菜品种为湖北省农业科学院蔬菜科技中心提供，分别为品种1、品种2、品种3、品种4、品种5、品种6六种类型大白菜品种。

将供试的种子播种在装有灭菌基质的花盆(8 cm×8 cm)内，出苗后每盆留1～3株。

1.2 试验方法

1.2.1 环境的选择 在抗病育种过程中，大田期对黑斑病进行抗性鉴定往往由于气候条件不适宜发病而无法进行，而苗期在室内进行鉴定则温湿度条件较易控制，鉴定周期短、速度快，能节省大量人力物力。为此，进行了室内苗期鉴定萝卜黑斑病抗性的研究，以找出更适于苗期抗病性鉴定的方法，确定苗期黑斑病适宜的诱导发病条件，并用筛选出的最适方法对大白菜种质资源进行苗期抗病性鉴定和分级，获得抗黑斑病材料。

1.2.2 影响因素的选择 为选择一个好的抗性鉴定方法，根据各国学者在这方面进行了系统研究，即选择从接种物浓度、苗龄、环境温度等各方面探讨影响大白菜黑斑病抗性鉴定的因素[9]。

1.2.3 接种方法的选择 接种方法包括拌种法、浸种法、土壤接种法、蘸根接种法、根部切伤接种法、喷雾法和针刺法[10]。在确定以接种物浓度、苗龄和温度这3个因素为变量的情况下，选择喷雾法对大白菜苗进行接种。

1.3 接种

将BHB菌株单孢分离同一时期的菌体都配制成孢子浓度为1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106个孢子/mL的悬浮液。

当大白菜苗长至3～4片真叶期时，将每个品种的1/3再均分成12份，平均分配到(18±1) ℃、(23±1)℃、(28±1)℃ 3个温度条件下的光照培养室中适应2 d，这2 d里，将培养室的温度每天上调1 ℃，之后保持不变[11，12]。将等体积的4个不同浓度的菌悬液以喷雾法分别接种于同一品种4份大白菜苗上，盖上保鲜膜保湿24～48 h后揭掉保鲜膜，诱导发病，接种后于每天早中晚各浇水1次，于接种后第4、7、10、14和18天进行病情调查[6]。

当剩余的大白菜苗长至5～6片真叶期时，再将每个品种的1/2搬回培养室进行同样的接种处理。待最后剩余的一批大白菜苗长至7～8片真叶期时，也对其进行同样的接种处理。

1.4 病情指数分级

真叶期接种鉴定调查分级标准[13]：0级，无病;1级，接种叶生褐色小点，无退绿斑;3级，接种叶生直径3 mm以下的退绿斑，无霉层;5级，接种叶生直径3 mm以上的退绿斑，有极少霉层，病斑不连成片;7级，接种叶生直径3 mm以上的退绿斑，有较多的霉层，病斑连成片;9级，接种叶病斑连成片，大面积枯死，霉层明显。

1.5 抗病性划分

病情分级调查后，计算病情指数：

病情指数=[Σ(病级数×该病级发病株数)/(最高发病级数×总调查株数)]×100[10]。

根据发病程度进行分级[13]。免疫(I)，病情指数=0;高抗(HR)，病情指数=0.10～11.11;抗病(R)，病情指数=11.12～33.33;中抗(MR)，病情指数=33.34～55.55;感病(S)，病情指数=55.56～77.77;高感(HS)，病情指数=77.78～100。

1.6 数据处理

所有数据均采用SPSS 11.5软件(LSD，P<0.05)处理，采用Microsoft Office Excel 2003进行制图。

2 结果与分析

2.1 接种天数对抗性表现的影响

由于在接种后第4天和第7天时大白菜苗的感病情况不太明显，而接种后第14天和第18天，多数大白菜苗因生理原因导致整株枯死，无法判断其发病情况，因而在这4个时期进行病情调查时所得到的数据有残缺或不准确，不能代表各个品种的大白菜苗的感病情况;而在接种后第10天时，这两方面的问题相对而言比较小，调查所得的数据比较全面，这也与严红等[14]的研究相符。因此，最终选择用接种后第10天调查所得的数据进行制图分析。

2.2 接种浓度对抗病性表现的影响

从图1可看出，随着接种物浓度的增加，其发病程度也相应加强。当接种物浓度为1.0×103个孢子/mL时，由于其中某些品种的抗性比较强，发病程度比较轻，而某些品种的抗性较弱，发病较重，不能进行正确的抗性评价;而当接种物浓度为1.0×106个孢子/mL时，6个品种都严重发病，且基本无差异，也不能进行正确的抗性评价;当接种物浓度为1.0×104个孢子/mL或1.0×105个孢子/mL时，植株发病比较重且有差异，参考柯桂兰等[9]的研究结果，可作为评价的浓度。

2.3 接种苗龄对抗病性表现的影响

从图2可以看出，随着苗龄的增大，植株发病程度有所下降，整体的抗病性在增强。当苗龄为5～6片真叶或7～8片真叶时，植株发病程度普遍较低且差异不大，不能进行正确的评价;当苗龄为3～4片真叶时，抗病性强的品种与抗病性弱的品种间的差异非常明显，可作为抗病性鉴定评价的苗龄。

2.4 接种温度对抗病性表现的影响

由图3可以看出，温度与植株发病程度呈正相关。当环境温度为(20±1)℃时，多数品种的发病程度都比较低，不能进行正确的评价;当环境温度为(30±1)℃时，6个品种发病程度都比较严重，且品种间的抗性差异与浓度和苗龄不一致，也不能进行正确的抗性评价;当环境温度为(25±1)℃时，品种间的发病程度比较明显且与浓度和苗龄的一致，参考柯桂兰等[9]的研究结果，可作为抗性评价的温度。

3 结论

本研究结果表明，在(25±1) ℃光照培养室内，选择浓度为1.0×104～1.0×105个孢子/mL的黑斑病病菌孢子悬浮液喷雾接种于苗龄为3～4片真叶的大白菜幼苗，保湿24～48 h，10 d后进行病情调查，可对大白菜种质资源抗黑斑病的级别进行正确评价。

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