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仙鹿健骨汤含药血清对成骨细胞增殖和ALP影响的实验研究

作者：吴剑静 王靖 吴云刚 沈权

【摘要】 [目的]观察仙鹿健骨汤含药血清对大鼠成骨细胞增殖和成骨细胞ALP的影响。[方法]取12周龄Wister大鼠40只，随机分为A、B、C、D、E、F六组，每组8只，分为仙鹿健骨汤低、中、高剂量组(A、B、C组)，阳性对照组(D组)、模型组(E组)及空白对照组(F组),制备成仙鹿健骨汤含药血清备用。成骨细胞建立采用新生SD乳鼠5只(24h内颅盖骨)进行体外细胞传代培养。观察仙鹿健骨汤含药血清对体外培养的新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化情况。[结果]B、C、D、F组间比较无显著性差异,与E组比较细胞增殖分化与ALP影响具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。[结论]仙鹿健骨汤含药血清能促进大鼠早期成骨细胞的增殖与分化。

【关键词】 骨质疏松症 仙鹿健骨汤 成骨细胞 碱性磷酸酶 大鼠

为了探索骨质疏松防治效果，我们对自主开发的中药制剂仙鹿健骨汤进行了临床和实验的系列研究，通过本实验来观察利用仙鹿健骨汤含药血清对体外培养成骨细胞的增殖及其ALP的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄的雌性Wistar大鼠48只，体重为200±20g，新生大鼠4只，由浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 实验药品 仙鹿健骨汤：仙灵脾、鹿角胶、骨碎补、杜仲、黄芪、白术、丹参、当归。药物煎剂由温州医学院附属第一医院中药房提供，水煎浓缩后含分别含生药0.5g/ml、1g/ml、2g/ml。α?D3：以色列梯瓦制药工业有限公司生产，批号(95)卫药准字J?10号，水溶液浓度为0.005μg/ml。氯氨酮：上海第一生化药业有限公司生产，批号国药准字H31021897。

1.3 实验方法

1.3.1 去势大鼠造模 取12周龄的雌性Wistar大鼠48只，体重约200g，取其中40只，腹腔注射戍巴比妥钠(3μg/100g)麻醉条件下，打开大鼠腹腔去除双侧卵巢，逐层缝合，随机分成5组。其余大鼠8只为空白组，共6组，每组8只：仙鹿健骨汤高、中、低剂量组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)、α?D3对照组(Ⅳ)、模型组(Ⅴ)、空白组(Ⅵ)。

1.3.2 血清制备 各组每天均以10ml/kg，分别结予仙鹿健骨汤水提液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)、α?D3水溶液(Ⅳ)及生理盐水灌胃(Ⅴ组和Ⅵ组)，1次/d，连续10d，动物处死前1h再灌胃1次，动物给予氯氨酮麻醉，右心室抽血，采集到的血液，4℃静置4h，3000r/min离心30min，收集血清，56℃水溶灭活补体。-20℃保存，血清保存时间不超过3周。使用前用培养基稀释，过滤膜除菌。

1.3.3 新生大鼠颅骨成骨细胞制备及培养 取新生大鼠(24h内)，无菌取颅骨，剔除黏附的结缔组织和血管，剪碎约1×1mm3，加含0.2%的Ⅰ型胶原酶和0.1%的透明质酸酶的消化酶消化，消化5个循环，每次20min，其间不时摇动，取3、4、5次消化的细胞悬液，1000r/min离心10min弃上清，沉淀的细胞用10%胎牛血清(FCS)DMEM培养液重悬，吹打均匀后，接种到培养瓶中，培养瓶置于37℃，5%CO2孵箱孵育，24h换液，待细胞60%～70%贴壁后，0.25%胰酶消化，本实验所用细胞均为原代培养。

1.3.4 不同稀释比的血清对成骨细胞增殖的影响 按细胞密度1×105个/ml加入96孔板，每孔100μl，24h后换5%FCS?DMEM培养基，每孔90μl。Ⅰ～Ⅵ组同时分别加入按1∶1、1∶3、1∶7稀释比的含药血清10μl，使其最终稀释比为1∶20、1∶40、1∶80，每种浓度重复4孔，继续培养72h，实验结束前4h加20μl的四唑氮盐(MTT)(5mg/ml)，继续在37℃，5%CO2条件下孵育，实验结束后，吸去培养液加甲臜溶解液0.1振摇15min，静置0.5h后，酶标仪检测其吸光度，在波长570nm比色。

1.3.5 不同稀释比的血清对成骨细胞ALP的影响 成骨细胞接种密度为1×105个/ml加入96孔板，细胞A1～A12行为空白调零，每孔100μl。加药方法同前，细胞加药后培养72h，培养结束时去除培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，加0.1%曲拉通(Triton)X?100 200μl裂解12h，吹打1min，取50μl细胞裂解液转移至另一96孔板，用PBS液作空白调零。各孔均加碱性磷酸酶检测试剂盒中新鲜配制的底物100μl，37℃孵箱孵育30min，加0.1N的NaOH终止反应。酶标仪检测其吸光度，在波长405nm比色。

1.4 统计学方法 实验数据采用SPSS10.0统计软件包进行分析。实验数据以均值±标准差表示,进行One?WayANOVA分析。

2 结果

2.1 仙鹿健骨汤对细胞增殖的影响 见表1。成骨细胞的活性各治疗组与模型组比较,空白组、阿法D3组以及仙鹿健骨汤在稀释比为1.0g/ml、2.0g/ml时有显著提高(P<0.05或P<0.01)，仙鹿健骨汤的低浓度组,与模型组比较无统计学意义,提示成骨细胞的活性未见明显增高，而中剂量组比低剂量组仙鹿健骨汤能更有效地促进成骨细胞的活性(P<0.05)。

2.2 仙鹿健骨汤对细胞ALP活性的影响 见表1。不同浓度仙鹿健骨汤组、空白组、阿法D3组与模型对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，提示仙鹿健骨汤和阿法D3均可促进成骨细胞ALP活性提高，但组间比较差异无统计学意义。

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