0ul u?PA含药血清样本、空白对照上清液或u?PA阳性对照,添加足够的去离子水使总体积为160μl。然后按试剂盒说明书进行操作，终止反应后立即在全自动酶标仪上405nm波长读取光密度值。

2.5 统计分析 以u?PA活性测定试剂盒中所提供的6个浓度的u?PA阳性标准品的浓度为横坐标，各浓度标准品所对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，依据标准曲线确定各浓度含药血清组OD值所对应的u?PA活性水平。运用Excel统计软件，采用计量资料的t检验对各组药物血清处理细胞上清的u?PA活性对应OD数值进行比较。

3 实验结果

实验结果显示，与空白对照组相比较，阿糖胞苷、清毒片和养正片药物血清对HL?60细胞培养液上清中u?PA的活性都有一定程度的影响，而以阿糖胞苷含药血清降低u?PA活性的效果最好，清毒片含药血清次之。各组u?PA活性对应光密度值变化情况见下表1。

表1 清毒片、养正片药物血清对u?PA活性的影响(略)

与空白组对比，*P<0.05，与空白组对比，**P<0.01

4 讨论

u?PA是一种丝氨酸蛋白水解酶，参与纤溶过程。一些研究发现，培养的白血病细胞中有纤溶活化剂(PAs)的高表达。用HL?60细胞作为AL细胞的模型研究细胞周围基质降解，证实丝氨酸蛋白酶以尿激酶前体的形式存在，基质金属蛋白酶9(MMP?9)前体的活化依赖于纤溶酶原活化剂/纤溶酶系统，并可被抑肽酶抑制，而MMP?9只在HL?60细胞存在的条件下检测到。结果表明HL?60细胞通过纤溶系统活化MMP?9，而MMP?9的活化促进了基质降解，增强了白血病细胞的侵犯能力[5]。AML患者TFPI、PAP值异常增高。治疗后TF、TAT在AML患者中维持高水平;u?PA、u?PAR在未缓解者持续增高;出血严重者PAP、u?PA显著升高。得出结论u?PA、u?PAR可作为部分AML预后判断的指标[6]。急性髓性白血病(AML)患者骨髓和血浆中u?PA的浓度均高于正常人，并且发现白血病细胞主要表达u?PA，而不产生t?PA[7]。

清毒片和养正片分别由清热解毒及扶正固本的中药组成，是广州中医药大学附属第一医院血液科专家制定，并长期用于各型白血病患者的中药复方制剂。在临床上，对于患者病情缓解和改善生存质量起到了良好的作用。本实验研究从含药血清作用方面，探讨了清毒片、养正片在体外对人急性早幼粒白血病细胞系HL?60生长状态及u?PA活性的影响，以便与临床研究结合起来，更好地解释这两种中药治疗AL的作用。同时更深入地了解AL疾病变化状态及中药作用途径。

通过u?PA活性测定的ELISA实验，发现清毒片、养正片与阿糖胞苷含药血清，均具有降低HL?60细胞上清中u?PA活性的作用。且随着药物浓度增加，u?PA活性单位OD值逐渐下降，药物浓度与u?PA活性单位OD值二者呈正相关。清毒片、养正片对HL?60细胞具有降低其产生u?PA活性物质的作用。提示这两种药物的药效与其改变白血病细胞u?PA活性的作用有关。

【参考文献】