1?5?3逆转录反应取4μLRNA模板做逆转录反应，反应体系如下：5倍逆转录buffer4μL[逆转录buffer成分为50mmol/L Tris HCl(pH8?0)、50mmol/L KCl、4mmol/L MgCl2、10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)]，上游引物(10pmol/μL)0?4μL，下游引物(10pmol/μL)0?4μL，dNTPs(10mmol/L)0?5μL，MMLV反转录酶(200U/μL)1μL，DEPC

9?7μL，RNA模板4μL，总体积为20μL。反应条件：37℃、1h，然后95℃、3min。

1?5?4荧光定量PCR反应以下反应均由PCR扩增仪扩增完成。反应体积为50μL，反应体系：5倍定量PCR buffer 10μL，上游引物F(10pmol/μL)1μL，下游引物R(10pmol/μL)1μL，dNTPs 0?5μL，荧光探针1μL，Taq 酶1?5μL，互补DNA(cDNA)5μL，重蒸水(ddH2O)30μL[PCR buffer成分为10mmol/L Tris?HCl(pH8?0)、50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2]。反应条件：93℃、2min，93℃、45s， 55℃、45s，共40个循环。

1?6免疫组化法检测各组小鼠肾组织TGF?β1含量采用免疫组化链霉亲和素—生物素过氧化物酶复合物(SABC)法。取免疫组化的肾组织切片，置于显微镜下，计数10个肾小球，光学放大400倍，图像经全自动图像分析系统处理，应用阳性单位(positive unit，PU)的计算公式计算阳性单位的数值，以各组的PU值进行比较。pPU=100%×(Ga-GA)/[(1-Aa)×Gmax]。注：Ga为阳性反应的平均灰度级;GA为整个视野的平均灰度;Aa为阳性反应的面积密度;Gmax为设定的灰度最高级(所用的是256)，所有数据均由系统自动算出。

1?7统计学方法采用SPSS 11?0统计软件进行统计分析。

2结果

2?1IgAN动物模型模型组小鼠尾静脉注射SEB后，死亡2只小鼠，其他小鼠均有不同程度的神态萎靡、皮毛蓬乱、反应性下降、食量减少等现象;而正常对照组小鼠活动度、反应性、进食量等均未见明显异常。模型组抽样测定小鼠24h尿蛋白定量为(11?72±4?42)mg/d，显著高于正常对照组的(5?54±1?46)mg/d(P <0?01)。光镜见模型组小鼠肾小球体积轻度增大，系膜细胞和基质中、重度增生，部分肾小球囊腔粘连，肾小球毛细血管管腔挤压变窄，而正常对照组小鼠肾小球未见明显异常(图1);免疫荧光检查结果显示模型组小鼠系膜区IgA+++，而正常对照组小鼠系膜区IgA-～±(图2)。

2?2肾组织TGF?β1含量的测定由表1可见，模型组小鼠肾组织TGF?β1含量显著高于正常对照组(P<0?05);益肾汤高、低剂量组小鼠肾组织TGF?β1含量均显著低于模型组(P<0?05);益肾汤高、低剂量组小鼠之间肾组织TGF?β1含量无显著性差异(P>0?05)。各组小鼠肾组织TGF?β1表达见图3：正常对照组有少量TGF?β1表达;模型组TGF?β1表达明显增强;益肾汤高、低剂量组TGF?β1表达减弱。表1各组小鼠肾组织TGF?β1 阳性表达单位值比较

2?3TGF?β1 mRNA表达结果TGF?β1 mRNA标准扩增曲线见图4;TGF?β1 mRNA标准曲线直线回归见图5;各样本TGF?β1荧光扩增曲线见图6;各组肾组织TGF?β1 mRNA表达的差异见表2。表2结果显示模型组小鼠肾组织TGF?β1 mRNA的表达显著高于正常对照组(P<0?05);益肾汤高、低剂量组小鼠肾组织TGF?β1 mRNA的表达均显著低于模型组(P<0?05);两个益肾汤治疗组小鼠之间肾组织TGF?β1 mRNA的表达无显著性差异(P>0?05)。图5为小鼠TGF?β1荧光定量标准回归曲线图，横坐标为起始拷贝数的对数，纵坐标为阈循环数nCt，相关系数r=0?998 6。线性关系良好，证实了nCt值进行定量的准确性。通过荧光定量PCR的扩增得知样本的nCt值，即可从该标准回归曲线上计算出该样本的起始拷贝数。 表2各组小鼠肾组织TGF?β1 mRNA定量表达比较