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作者：万启军，何永成，石成钢，洪国保，胡斌，栾韶东

【摘要】 【目的】观察益肾汤对实验性IgA肾病(IgAN)模型小鼠肾组织转化生长因子β1(TGF?β1)表达的影响。【方法】选用BALB/c小鼠，采用口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B方法复制小鼠IgAN模型，抽样检测造模小鼠24h尿蛋白定量、肾组织过碘酸雪夫反应(PAS)染色及免疫荧光检查，确定造模成功后随机分为模型组，益肾汤高、低剂量组(剂量分别为0?1、0?05g·kg-1·d-1)，并设正常对照组;采用荧光定量聚合酶链反应(FQ?PCR)法检测各组小鼠肾组织TGF?β1mRNA表达，免疫组化法检测各组肾组织TGF?β1含量。【结果】模型组肾组织TGF?β1mRNA表达及TGF?β1含量均显著升高(P<0?05);益肾汤高、低剂量组肾组织TGF?β1mRNA表达及TGF?β1含量均显著降低(P<0?05)。【结论】益肾汤治疗IgAN的作用与抑制肾组织中TGF?β1的分泌及其mRNA表达有关。

【关键词】 益肾汤/药理学;IgA肾病/中药疗法;肾/病理学;转化生长因子β;疾病模型，动物;小鼠

研究证实细胞因子在IgA肾病(IgAN)的发生发展过程中起重要作用，其中，转化生长因子β1(TGF?β1)是公认的最重要的致纤维化因子[1]。本研究观察了TGF?β1在实验性IgAN小鼠肾组织中表达的特点及中药方剂益肾汤对TGF?β1的影响，现报道如下。

1材料与方法

1?1益肾汤组方及制备益肾汤组成：黄芪15g、生地20g、牡丹皮10g、熟地15g、赤芍10g、当归10g、山药15g、茯苓15g、山茱萸15g、金樱子15g、枸杞子15g、白茅根30g、女贞子15g、旱莲草15g、仙鹤草20g。按照“人—鼠用药剂量转换公式”计算，浓缩成高浓度(相当于成人剂量的2倍)及低浓度(相当于成人的每日用量)2种剂型，原液装瓶，高压消毒后密封保存，备用。

1?2实验动物BALB/c小鼠60只，鼠龄8～10周，体质量18～22g，雌性。由中山大学实验动物中心提供，动物许可证：SCXK(粤)2004?0011，动物批号：NO?0018045，粤监证字：2006A003。

1?3主要试剂与仪器牛血清白蛋白(BSA)由深圳晶美生物有限公司提供，批号：RF101?010;POINT GV20 (BAIHUI);POINT SP6 (SANYINJIAO)葡萄球菌肠毒素B(SEB)由中国军事医学科学院微生物流行病研究所提供;Trizol试剂(Invitrogen公司);Primer express 2?0 软件(美国Applied Bio?system Inc.);PE 9600型PCR仪(美国Perkin Elmer公司);逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)试剂盒(德国QIAGEN 公司);脱氧核糖核苷酸(dNTPs)(10mmol/L，华美公司);PE 7000型荧光定量仪(美国Perkin Elmer公司);PCR buffer(美国ABI公司);dNTPs (25mmol/L,Sigma公司) ;荧光探针(10pmol/μL，上海生工);Taq 酶(美国ABI公司);德国KONTRON IBAS 2?5全自动图像分析系统。

1?4造模与分组按文献[2]方法复制小鼠IgAN模型：隔日灌服200mg/kgBSA，6周后按20mg/kg每日1次定期尾静脉注射BSA连续3d。8周时按0?5mg/kg尾静脉注射SEB，每周1次，连续3周，观察至12周末。造模第5周末，抽样检测造模小鼠24h尿蛋白定量、肾组织过碘酸雪夫反应(PAS)染色及免疫荧光检查，并与正常小鼠对照，确定IgAN模型成功后，随机分为模型组，益肾汤高、低剂量组，并设正常对照组;益肾汤高、低剂量分别以0?1、0?05g·kg-1·d-1剂量灌胃给药，模型组、正常对照组灌服等容积蒸馏水，每日1次，均连续7周。

1?5荧光定量聚合酶链反应法(FQ?PCR)检测各组小鼠肾组织TGF?β1mRNA的表达

1?5?1肾组织RNA的提取取肾组织块(约100mg)置匀浆器，加Trizol1mL，冷冻匀浆，转置于1?5mLEppendorf 管，加入氯仿0?2mL，盖紧盖子，用力摇动15s，15℃～30℃孵育2～3min，4℃、12 000r/min离心15min;取上清液至另一个1?5mLEppendorf管，加与上清液等容积的异丙醇，15℃～30℃孵育样品10min，4℃、12 000r/min离心10min;弃上清液，体积分数75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃、7 500r/min离心5min;弃乙醇，空气或真空干燥5～10min(不要完全干燥)，加焦碳酸二乙酯水(DEPC)溶解RNA，-80℃保存备用。若长期保存，加入2?5倍容积乙醇，置-80℃保存。

1?5?2引物的设计和合成采用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。引物和探针由中山大学达安基因诊断中心合成并纯化。序列如下：TGF?β1：Forward Primer:5’?CGGAATACAGGGCTTTCGATT?3’;Reverse Primer:5’?GCTGATCCCGTTGATTTCCA?3’;TaqMan Probe:5’?FAM?AGCGCTCACTGCTCTTGTGACA?TAMRA?3’。GAPDH(内参照基因)：Forward Primer:5’?TGTGTCCGTCGTG GATCTGA?3’;Reverse Primer:5’?TGCCTGCTT CACCACCTTCT?3’;TaqMan Probe:5’?FAM?TGCCGCCTGGAGAAACCTG CC?TAMRA?3’。