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低剂量顺铂节律化疗抗血管生成作用的实验研究

【摘要】 目的 探讨低剂量顺铂节律化疗对体内外血管生成的抑制作用。方法 采用MTT法检测低剂量顺铂节律化疗对人脐静脉内皮细胞HUVECs、人肝癌细胞株HepG2增殖的影响;采用流式细胞术检测细胞周期观察其对HUVECs、HepG2生长的影响;采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型,观察其对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果 低剂量顺铂(7.5～750.0 μg/L)持续作用24、48、72 h,对HUVECs具有抑制增殖作用，且在7.5 ～750.0 μg/L 范围内呈现剂量和时间依赖性，低剂量顺铂组的吸光度值明显低于对照组,差异有显著意义(F=14.57～285.44，q=3.50～7.63，P<0.05),且当顺铂浓度达到750.0 μg/L时对内皮细胞HUVECs增殖抑制作用达到饱和。相同条件下,低剂量顺铂对人肝癌细胞株HepG2则未显示出抑制作用,实验组的吸光度值与对照组比较差异无显著意义(F=0.71～1.18，P>0.05)。流式细胞仪检测显示低剂量顺铂组处理HUVECs 细胞48 h 后与对照组比较,随顺铂浓度增大，G0/G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例明显增多,其差异有显著性(F=6.44～12.30,q=3.26～8.47,P<0.05);低剂量顺铂组处理HepG2细胞48 h后与对照组比较,各期细胞比例无明显改变，差异无显著意义(F=0.03～0.10，P>0.05)。低剂量顺铂持续作用对鸡胚尿囊膜的血管发生具有显著影响,低剂量顺铂组抑制百分率为(30.0±5.0)%～(50.0±5.0)%，与生理盐水对照组比较差异有显著性(F=259.04,q=7.76～38.80,P<0.05)。结论 低剂量顺铂节律化疗体外有抑制血管内皮细胞生长、体内有抑制血管生成作用。

【关键词】 顺铂;药物疗法;新生血管化,病理性;绒毛尿囊膜

20世纪70年代初,FOLKMAN[1]提出通过抑制肿瘤新生血管的生成来抑制肿瘤的生长,为肿瘤的治疗开辟了新的思路。近几年研究显示，持续或高频率给予比最大耐受剂量(MTD)小得多的单次剂量更有效,不仅能降低毒性反应,而且能提高抗肿瘤效果[2]。此外,这种方案适合与靶向药物及毒性相对低的抗癌药物合用。最新的定义将此称为“节律化疗”,即高频率甚至每天1次给予比MTD低得多的化疗药物,且不伴较长的间歇期。顺铂为一含铂无机络合物，抗瘤谱广、疗效高，具有与多种抗癌药协同作用的优点，是常用的化疗药物，但其毒副作用较大，大剂量、多疗程应用可引起体质量下降及肝脏、肾脏毒性等，并可成为不可逆损伤，其是否有抗血管形成作用目前国内外少见报道。本研究探讨低剂量顺铂节律化疗对体内外血管生成的抑制作用, 为临床上应用低剂量顺铂抗肿瘤血管生成治疗提供实验依据。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及细胞培养 人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 由美国Sciencecell公司生产，使用含体积分数0.10 FBS、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的ECM条件培养基常规培养,第4～6代细胞用于实验。HepG2细胞系本实验室常规培养，使用含体积分数0.10 FBS、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基常规培养。受精White Leghorn 6日龄鸡胚(青岛群兴种禽有限公司),白色,37.5～38.0 ℃,湿度为60%～80%,恒温全自动孵化设备孵育。

1.1.2 主要试剂 ECM培养基由美国Sciencecell公司生产;DMEM培养基和胎牛血清(FBS)由兰州民海生物工程公司生产; 注射用冻干型顺铂，购自齐鲁制药有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、 甲基纤维素系Sigma公司产品;二甲基亚砜(DMSO)由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞增殖抑制试验(MTT法)[3] 收集对数生长期的HUVECs及HepG2细胞，以0.5×104/mL分别接种于96孔培养板,于37 ℃、含体积分数0.05 的CO2饱和湿度培养箱中培养,24 h后换入顺铂浓度分别为 7.5、75.0、750.0、7 500.0 μg/L含药培养液,对照组用不含药物的培养液换液,然后移至37 ℃恒温、含体积分数0.05 的CO2饱和湿度培养箱中继续培养，24、48、72 h后各取出一块培养板,每孔加入5 g/L MTT 20 μL,继续培养4 h后,取出96 孔培养板，1 000 r/min离心5 min后,弃孔内培养液。每孔加入150 μL的DMSO,振荡10 min,酶标仪测定570 nm波长处的吸光度值(A值),细胞存活率=药物实验组A值/细胞对照组A值×100%。

1.2.2 细胞周期分析 收集对数生长期HepG2细胞及HUVECs,以1×109/L细胞浓度10 mL接种于100 mL培养瓶中,孵育24 h。按实验分组分别加入相应药物,继续培养48 h 后取出各组细胞一瓶,离心,预冷PBS (pH 7.40) 洗2次。将经PBS 洗后的细胞悬液快速注入装有预冷1 mL含体积分数0.75乙醇的EP 管中,混匀,4 ℃冰箱过夜。PBS洗2次,将等体积的细胞悬液和碘化丙啶(PI)染液混合,4 ℃放置30 min。混合液过300目尼龙网以除去杂质。将样品放入流式细胞仪测定,所得数据输入Macintish 650型计算机,分析细胞周期分布。

1.2.3 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)体内血管生长试验[4] 将鸡受精卵在37 ℃、60%相对湿度恒温箱中孵育至血管生长高峰时(第7天)，在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区域(约胚头右下方0.5～1.0 cm处)，划定1 cm×1 cm开窗位置，在鸡胚气室端钻1 mm小孔并穿透壳膜。在蛋壳开窗位置用小砂轮磨切开窗，体积分数0.75乙醇消毒，用橡皮吸头从气室小孔轻轻吸气使绒毛膜下沉，用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出鸡胚尿囊膜。将甲基纤维素薄片放置于尿囊膜毛细血管新生区,用微量进样器将不同浓度的顺铂20 μL滴入纤维素薄片上。对照组用生理盐水，滴入量同顺铂组，用消毒薄膜封窗后放人孵化箱，继续孵化。每天追加相同剂量的药物,72 h后揭去消毒薄膜，加入适当甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15 min。待绒毛尿囊膜血管中的血液凝固后,将薄片周围3 cm直径区域内的尿囊膜剪下,光学显微镜下观察薄片周围毛细血管生长情况,计算其抑制百分率。

1.3 统计学处理

实验数据采用SPSS 13.0 与PPMS 1.5[5]统计软件进行处理,统计方法采用方差分析。

2 结果

2.1 低剂量顺铂节律化疗对HUVECs和HepG2细胞的抑制作用

低剂量顺铂作用HUVECs细胞24、48、72 h,结果显示均具有抑制作用,且在一定的范围内呈现剂量和时间依赖性，低剂量顺铂组的吸光度值明显低于对照组,差异有显著性(F=14.57～285.44，q=3.50～7.63，P<0.05),当顺铂浓度达到750.0 μg/L时对内皮细胞增殖抑制作用达到饱和。相同条件下,低剂量顺铂对人HepG2细胞则未显示出抑制作用,低剂量顺铂组的吸光度值与对照组比较差异无统计学意义(F=0.71～1.18，P>0.05)。见表1。

2.2 流式细胞仪检测细胞周期变化