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青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测

【摘要】 目的 了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺(PZA)分离株pncA基因突变的情况，探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BACTEC?460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测，聚合酶链反应?单链构象多态性(PCR?SSCP)技术检测pncA基因的突变。结果 76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段，69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株，其中耐药株13株，敏感株5株;SSCP泳动正常者51株，其中耐药株14株，敏感株37株。结论 青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变;PCR?SSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变，可弥补常规药敏试验的不足。

【关键词】 分支杆菌 结核 基因 pncA BACTEC培养方法 聚合酶链反应 单链构象多态性

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the mutations of pncA gene in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis and the relationship between pncA gene and pyrazinamide (PZA)?resistance in Qingdao area. MethodsFrom 76 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis, the routine culture and drug susceptibility detection were done by BACTEC?460 system, and the mutations of pncA gene detected by PCR?SSCP.ResultsAmong the 76 isolates, 44 strains were PZA?sensitive and 32 PZA?resistant by　the BACTEC?460 system. With PCR?SSCP, 18 strains displayed abnormal pncA SSCP profile, in which, 13 were PZAe?resistant and five PZA?sensitive. Fifty?one strains displayed normal pncA SSCP profile, in which 14 were PZA?resistant and 37 PZA?sensitive. ConclusionMutation of pncA gene might be one of the major molecular mechanisms in pyrazinamide?resistance of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. PCR?SSCP appears to be a promising method for rapid detection of pyrazinamide?resistant Mycobacterium tuberculosis, preferable to the routine drug?susceptibility test.

[KEY WORDS]Mycobacterium tuberculosis; genes, pncA; BACTEC; polymerase chain reaction; single?strand conformation polymorphism

近年来,结核病疫情呈现全球性明显回升趋势，其主要原因之一是耐药菌株的产生和播散，尤其是耐多药菌株的涌现。目前对结核分支杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶位及其相关基因的突变位点上。吡嗪酰胺(PZA)自1949年首次用于肺结核治疗以来，作为第一线抗结核药物应用已有50多年的历史。近几年结核分支杆菌临床分离株对其耐药趋势日渐上升，并且呈现与异烟肼和利福平同时耐药的现象[1]。然而，目前对PZA的作用机制及耐药分子机制尚不清楚。本文应用BACTEC?460培养系统进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测，聚合酶链反应?单链构象多态性技术(PCR?SSCP)检测结核分支杆菌pncA基因，旨在了解青岛地区结核分支杆菌耐PZA分离株的pncA基因突变情况，探讨其与耐PZA之间的关系,以建立新的、快速有效的结核分支杆菌药敏试验方法，弥补常规药敏试验的不足。

1 材料和方法

1.1 标本来源

76例结核分支杆菌临床分离株来自青岛市结核肺病防治研究所2002年1～12月诊治的肺结核病人。其中初治病人60例，复治病人16例;男43例，女33例;年龄21～83岁，平均52岁。

1.2 主要试剂与仪器

结核分支杆菌标准株(H37Rv)购自中国药品生物制品检定所，BACTEC?460培养系统试剂购自BECTON?DICKINSON公司，dNTP、TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、PCR Marker均购自Promega公司，PCR扩增仪为PE公司480型。

1.3 痰标本的处理及PZA药敏试验

根据文献[2]的方法进行菌种鉴定和药敏试验。痰标本经消化、离心，接种至含有C14?棕榈酸的12B培养基，37 ℃培养。第1周上机检测生长指数(GI)值2～3次，以后每周测定1次，至第6周。结果判定标准如下：GI值0～10，培养阴性;GI值11～50，培养阳性;GI值51～100，可进行结核分支杆菌复合群与非结核分支杆菌鉴定;GI值500～800，可进行药物敏感性试验。

结核分支杆菌阳性标本一部分提取DNA，-20 ℃保存备用;另一部分在12B培养基内加入定量PZA进行药敏试验，同时以蒸馏水代替PZA作为对照。按以下标准判定结果：对照组的生长指数(AGI)值>测试组的生长指数(△GI)值为敏感;AGI值<△GI值为耐药;AGI值=△GI值为临界。

1.4 PCR检测结核分支杆菌IS6110及pncA基因

1.4.1 PCR引物的设计与合成 根据Gene Bank中结核分支杆菌标准株H37Rv全基因序列,利用DNAStar软件分别设计对应于结核分支杆菌复合群保守序列IS6110及pncA基因序列的PCR引物。其中引物INS?1和INS?2扩增IS6110基因，引物pncA?1和pncA?2扩增pncA基因。引物序列及扩增片段长度见表1。引物由上海生工生物公司合成(PAGE纯化)，纯水稀释分装，保存于-20 ℃备用。

1.4.2 目的基因的PCR扩增 取经BACTEC?460培养系统培养阳性的增菌液1.5 mL于无菌干燥玻璃试管中，酚?氯仿法提取DNA。以提取的DNA为模板进行PCR扩增，其循环条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环;72 ℃延伸10 min。20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测结果。表1 引物序列及其产物

1.5 PCR?SSCP分析

pncA的PCR扩增产物变性后经80 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后可见野生型的单链DNA与H37Rv标准对照的单链DNA位于同一位置，而突变型的单链DNA低于或高于H37Rv标准对照的单链DNA水平，以此来确定突变例数。

2 结 果

2.1 BACTEC?460培养系统检测

从130份临床痰标本中共检出76株结核分支杆菌，阳性率为58.5%。其中对PZA敏感44株，耐药32株，耐药率为42.1%。

2.2 PCR扩增

本文76株结核分支杆菌临床分离株均扩增出IS6110基因(245 bp)的目的条带，与H37Rv标准株一致，表明这些临床分离株均为结核分支杆菌。69株扩增出pncA基因的特异序列(254 bp)。7株未检出pncA基因扩增产物，其中耐药5株，敏感2株(图1)。

2.3 PCR?SSCP检测结核分支杆菌pncA基因突变的结果

以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照，69株结核分支杆菌临床分离株中，SSCP泳动异常者18株，其中耐药13株，敏感5株;泳动正常者51株，其中耐药14株，敏感37株(图2)。

2.4 PCR?SSCP与BACTEC?460培养系统药敏试验结果比较

BACTEC?460培养系统药敏试验结果显示，低度耐药有8株SSCP泳动异常，13株SSCP泳动正常;高度耐药有5株SSCP泳动异常，1株SSCP泳动正常。PZA耐药株pncA基因突变率为48.1%(13/27)，PZA敏感株pncA基因突变率为11.9%(5/42)。BACTEC?460培养系统PZA药敏结果与PCR?SSCP基因突变分析结果比较，差异无显著性(χ2=3.37,P>0.05)。见表2。表2 BACTEC?460 PZA药敏结果与PCR?SSCP分析结果的比较

3 讨 论