1.1.2血清来源及分组采集所有患儿手术前、仅经一般治疗后的血清(选取病例的伤后时间相对固定)用于ELISA分析。正常人血清由年龄和性别匹配的10例志愿者提供。标本的获取均经患儿家长同意并签署知情同意书。

1.2试剂与仪器Ngb酶联免疫检测试剂盒(Sigma公司);大鼠抗Ngb多克隆抗体(美国SantaCruz公司);生物素二抗(美国SantaCruz公司);辣根过氧化物酶偶联的羊抗大鼠(美国SantaCruz公司);正常封闭血清、DAB显色试剂盒(北京中山生物技术有限公司);PVDF膜(Millipore公司);SP免疫组化试剂盒(迈新生物公司);磷酸、甘油、乙醇、EDTA二钠为国产分析纯。IPGphor 等电聚焦仪、EttanDALTⅡ垂直电泳槽及ImageScanner扫描仪均为美国AmershamBio-sciences公司产品;MicroQ-TOF质谱仪为美国Wa-ters公司产品;石蜡自动包埋脱水机及石蜡自动连续切片机为德国Leica公司产品;混匀仪为美国 Thermo公司产品;Multiskanspectrum型酶标仪为美国热电公司产品;AmershamEPS301型水平式电泳槽为美国 PharmaciaBiotech公司产品;Alphamager2200型凝胶成像系统为美国AlphaInnotech公司产品。

1.3方法

1.3.1脑组织总蛋白的提取参照Araki等[4]的方法将处理过的标本取出,置于研磨管中,加入0.2mL组织裂解液在冰上将组织磨碎,4℃下12000r/min离心60min。取5μL上清液用于蛋白质浓度测定,剩余上清液冻存于-80℃备用。

1.3.2二维凝胶电泳操作步骤按照IPGphor等电聚焦系统使用指南进行。组织总蛋白提取物与水化液混合至总体积为450μL蛋白质样本,置于 IPGphor等电聚焦仪上,按如下条件:30V水化14h后经500V1h、1000V1h、8000V10h进行等电聚焦。等电聚焦结束后,分别于 10mL平衡A液和平衡B液中各平衡15min,转移至12.5%SDS-PAGE胶上端,在垂直电泳槽上进行第二向垂直电泳。电泳结束后,对2-DE胶进行考马斯亮蓝染色。实验重复3次。

1.3.3凝胶图像分析应用ImageScanner扫描仪扫描考马斯亮蓝染胶,并运用LabScan扫描软件获取图像,PDQuest2-DE软件比较分析对照组儿童和脑挫裂伤患儿脑组织蛋白二维电泳图谱的差异,选取表达水平相差2倍以上的蛋白质点进行质谱分析。

1.3.4质谱分析参照李美香等[5]的方法,将萃取后冻干的样品用萃取工作液约4μL溶解,用Tips反复在样品液中吸进压出循环操作,充分混匀后取 0.6μL点于点样板上,再加0.6μLCCA基质工作液置空气中自然风干。肽段样品用MALDI-TOF-MS检测,质谱检测是在正离子反射模式中进行,N2激光源,波长337nm,飞行管长3m,加速电压20kV,反射电压23kV。质谱使用基质峰和胰酶自动降解离子峰作为内部标准校正。