1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和培养基

　　红曲菌种：中国工业微生物菌种保藏中心红色红曲霉Monascus ruber 5031。

　　斜面培养基：取50 g大米，洗净加水800 mL，煮成稀粥，冷却到60~65 ℃。将150 g麦芽粉掺入大米粥中搅拌均匀，放入55~60 ℃保温箱内糖化4 h，取出过滤。取250 mL加250 mL水，加2%的琼脂，装瓶、灭菌。

　　菌丝生长培养基：以上培养基不加琼脂。

　　1.1.2 仪器与试剂

　　日立高速冷冻离心机。Monacolin K 标准品，购自Sigma公司。PCR引物由上海生工合成。Taq酶采用上海生工的Taq Plus。上海生工的胶回收试剂盒UNIQ-10。TaKaRa公司的pMD-18T克隆载体。

　　1.2 方法

　　1.2.1 培养方法

　　用2 mL无菌水冲洗孢子，接入固体斜面培养。

　　固体斜面培养7 d后，以5 mL水洗下，稀释至浓度为107个/mL，取2 mL加入100 mL菌丝生长培养基，培养温度28 ℃，转速150 r/min。培养4 d。

　　1.2.2 红曲基因组DNA的提取

　　根据文献[9]的方法改进而成。取1 g菌丝，液氮中磨成粉状，加入5 mL 2×CTAB缓冲液[100 mmol/L trisCl (pH 8.0),20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,2%(ρ)CTAB,2%(ρ)β巯基乙醇]，58 ℃ 1 h，冷至室温后加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)抽提，10 000 g离心10 min，取上清，加入0.1倍体积10% CTAB0.7 mol/L NaCl溶液，温和摇动，再加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)抽提，10 000 g离心10 min，取上清，加入2/3体积预冷异丙醇沉淀DNA，1 000 g离心15 min，沉淀溶于100 μL TE中，加入RnaseA至终质量浓度100 μg/mL，37 ℃作用2 h，加入等体积酚氯仿(1∶1)抽提，10 000 g离心10 min，上清中加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA，沉淀用70%乙醇洗1遍，风干，溶于TE，4 ℃保存。

　　1.2.3 PCR引物的设计

　　3对PCR引物的设计详见表1。表1 PCR引物的设计(略)

　　第1组引物是参照Thomas等[10]针对土曲霉的lovB基因的KS功能域序列设计的引物设计的。

　　1.2.4 PCR反应

　　①反应体系：200 μmol/L dNTPs,1 U Taq酶，2.625 mmol/L MgCl2,2 μmol/L MgSO4,10 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,20 mmol/L TrisHCl(pH 8.75),0.1% Tritonx100,0.1 mg/mL BSA,模板40 ng(基因组DNA和cDNA),引物60 ng，总反应体积20 μL。②热循环条件：94 ℃预变性5 min，之后以94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min程序45个循环，延伸72 ℃ 10 min。

　　1.2.5 lovB扩增片段的克隆与测序

　　回收及克隆红曲的lovB引物扩增产物中约750 bp的片段，其中连接反应液成分为pMD18T载体1 μL，PCR产物4.5 μL，含T4连接酶和连接酶缓冲液的solutionⅠ5 μL，在16 ℃连接2 h。大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化均按分子克隆指南方法操作。克隆的片段交由TaRaKa公司完成测序。

浅谈Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析就为朋友们整理到此，希望可以帮到朋友们！ 

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