2  薄层色谱鉴别

2.1  苦参

取清肺抑火片5片,研细,加浓氨试液3 mL、三氯甲烷50 mL,放置过夜,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷2 mL使溶解,作为供试品溶液。另取苦参对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。另取苦参碱对照品,加乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作为对照品溶液。再按处方比例和制备方法制备缺苦参的阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验[3],吸取上述供试品溶液2 μL,对照药材溶液10 μL,对照品溶液8 μL,阴性对照溶液2 μL,分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)为展开剂,进行第1次展开,晾干,再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)10 ℃以下放置的上层溶液进行第2次展开,两次展距均为8 cm,以稀碘化铋钾为显色剂。供试品色谱中,在与对照药材和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的橙色斑点,阴性无干扰。

2.2  黄柏

取清肺抑火片1片,研细,加甲醇10 mL,加热回流30 min,滤过,滤液作为供试品溶液。另取黄柏对照药材50 mg,加甲醇5 mL,同法制成对照药材溶液。另取盐酸小檗碱对照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。再按处方比例和制备方法制备缺苦参的阴性样品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述溶液各1 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶6∶1∶1)为展开剂,置氨蒸气预饱和的展开缸内,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性无干扰。

2.3  前胡

取清肺抑火片10片,研细,加三氯甲烷40 mL,超声处理10 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。另取前胡对照药材0.5 g,同法制成对照药材溶液。再按处方比例和制备方法制备缺前胡的阴性样品,按供试品溶液制备方法制成缺前胡的阴性对照溶液。照薄层色谱法试验,吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯(19∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性无干扰。

3  含量测定

3.1  色谱条件

色谱柱：ODS C18(10 μm,250 mm×4.6 mm);流动相：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2);检测波长280 nm;流速：1 mL/min;柱温25 ℃;理论塔板数按黄芩苷峰计算不得低于2 500。

3.2  溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取在60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含黄芩苷60 μg的溶液,即得。

供试品溶液的制备：取本品10片,除去薄膜衣,研细,取细粉约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇100 mL,密塞,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：取除黄芩以外的其余药味,按制备工艺制备不含黄芩的样品,按供试品溶液制备方法制成不含黄芩的阴性对照溶液。

3.3  测定法

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL,注入高效液相色谱仪,测定,即得。

3.4  线性关系的考察

制备浓度为65 μg/mL的黄芩苷甲醇溶液,微孔滤膜滤过,依次进样2.5、5、7.5、10、15、20 μL,对所得峰面积和各对照品进样量作回归处理,得黄芩苷标准曲线,并计算得黄芩苷回归方程：Y=2 734.336 24X-4.427 33,r=0.999 9。结果表明,黄芩苷的量在0.163～0.975 μg线性范围良好。

3.5  精密度试验

取同一批号样品溶液,重复进样6次,每次10 μL。结果供试品中,黄芩苷峰面积积分值RSD=0.8%(n=6),表明仪器精密度良好。

3.6  重现性试验

取同一批样品(批号20070401),分别按供试品溶液制备方法制备5份样品,照上述色谱条件测定,测得黄芩苷的平均含量19.48 mg/g,RSD=1.35%(n=5)。

3.7  稳定性试验

取同一批号样品溶液,每隔2 h进样1次,每次10 μL,进样6次,结果6次含量RSD=2.27%,表明样品溶液在10 h内基本稳定。

3.8  回收率试验

取已知含量的清肺抑火片样品(批号20070401)6份,分别添加黄芩苷对照品适量,按供试品溶液的制备方法制成供试溶液,依法测定,结果平均回收率97.43%,RSD=1.97%,见表1。表1  回收率测定结果(略)

3.9  样品的含量测定

按上述方法测定3批样品中黄芩苷的含量,每份平行测定3次,结果见表2。表2  样品的含量测定结果(略)

3.10  阴性干扰试验

取阴性对照品溶液,按黄芩苷含量测定项下的方法进行测定。结果供试品色谱图中,在与黄芩苷对照品色谱峰相应的位置上,没有色谱峰出现,表明处方中其它药味对其测定无干扰[4]。结果见图1。

4 讨论

方中黄柏、前胡的薄层色谱具有荧光特性,无须喷显色剂, 3,5-二硝基水杨酸比色法测定可以快速进行定性鉴别。鉴别前胡时,溶剂系统的极性需要适当调整,方能显出荧光斑点。实验过程试用了3∶1、3∶2、1∶1的石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯[3,5]系统,结果斑点重叠;改用三氯甲烷-乙酸乙酯系统时,供试品斑点能明显分开,此系统调节比例为19∶1时,展距适中,斑点清晰,达到较好的分离。对黄柏的鉴别应预先饱和,否则边缘效应严重,应先饱和10～20 min,再展开。苦参鉴别应注意显色剂及展距,展距为8 cm,分离度适中,显色剂为稀碘化铋钾时,色谱斑点清晰;若显色剂为碘化铋钾,则背景重,色谱斑点效果一般。

黄芩苷是黄芩的主要有效成分,上述含量测定条件为2005版《中华人民共和国药典》(一部)黄芩项下的含量测定方法,复方制剂在此条件下,黄芩苷与其它峰能够很好的分开,无需调整流动相的极性,便可进行定量研究。本方法操作简单,结果可靠,可用于该制剂的质量控制,进一步完善了该制剂的质量标准。

【参考文献】

[1] 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂[S].第2册.1990. 248.

[2] 李玉仿.清肺抑火片的薄层分析[J].天津药学,2002,14(2)：66.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.141.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典中药薄层色谱彩色图集[M].广州：广东科技出版社,1993.57.

[5] 苗明三,李振国.现代实用中药质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社,2000.89.

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