第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表达载体的构建

第三部分：T-cadherin基因的真核表达及生物活性分析

创新点：首次将T-cadherin基因转染黑素瘤细胞

拟解决的关键问题：通过RT-PCR反应扩增出T-cadherin的基因全长。

预期成果及提供形式：

观察T-钙粘蛋白在正常皮肤组织细胞、痣细胞及黑色素瘤细胞中的表达情况!

进一步阐明T-钙粘蛋白作用机制

T-钙粘蛋白基因转染入黑色素瘤细胞后观察对其增殖和转移活性的抑制情况，探索临床诊断和治疗黑色素瘤及其它肿瘤的方法!

三、研究方案(包括研究方法、技术路线、研究进度安排)

研究方法：

第一部分：正常表皮组织、痣细胞及黑色素瘤细胞中T-cadherin表达情况

免疫组织化学和免疫细胞化学

1.材料：从正常人皮肤切取的痣组织，人黑色素瘤细胞株

2.主要试剂和溶液

(1)第一抗体：兔抗人T-cadherin 抗体

(2)第二抗体：生物素标记羊抗兔IgG

(3) “三抗” ：链亲和霉素标记HRP

3.设备

4.方法

(1)冷冻切片的免疫染色程序

(2)活细胞的免疫染色程序

5.荧光显微镜检

注意：为保证结果的可靠性应该同时设有对照

阳性对照(正常组织) ;

阴性对照(PBS代替一抗)以证明抗体的特异性。

第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表达载体的构建

1.材料：

(1)组织和细胞

(2)菌株与质粒

(3)工具酶

(4)试剂

(5)仪器

2.方法

(1)引物的设计

(2)总RNA的提取：异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法

(3)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析其质量，观察所提RNA有无明显降解;

(4)逆转录RT反应 ：为了证实RT反应的成功设管家基因GAPDH为内对照

(5)PCR扩增 ：利用上下游引物，在DNA聚合酶下对目的片段进行扩增，PCR过程设β-actin为内对照

(6)PCR产物的回收、纯化

(7)PCR产物的克隆

(8)DNA序列测定

(9)真核重组表达质粒的构建

(10)阳性重组质粒的鉴定和筛选

(11)质粒的大量提取

(12)转染黑色素瘤细胞

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