4.方法

(1)冷冻切片的免疫染色程序

(2)活细胞的免疫染色程序

5.荧光显微镜检

注意：为保证结果的可靠性应该同时设有对照

阳性对照(正常组织) ;

阴性对照(PBS代替一抗)以证明抗体的特异性。

第二部分 T-cadherin基因克隆和真核表达载体的构建

1.材料：

(1)组织和细胞

(2)菌株与质粒

(3)工具酶

(4)试剂

(5)仪器

2.方法

(1)引物的设计

(2)总RNA的提取：异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法

(3)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析其质量，观察所提RNA有无明显降解;

(4)逆转录RT反应 ：为了证实RT反应的成功设管家基因GAPDH为内对照

(5)PCR扩增 ：利用上下游引物，在DNA聚合酶下对目的片段进行扩增，PCR过程设β-actin为内对照

(6)PCR产物的回收、纯化

(7)PCR产物的克隆

(8)DNA序列测定

(9)真核重组表达质粒的构建

(10)阳性重组质粒的鉴定和筛选

(11)质粒的大量提取

(12)转染黑色素瘤细胞

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