经四川大学华西口腔医院伦理道德委员会的许可，征得参与者知情同意并多次家访求证，收集患者及其家系成员的详细资料。询问、检查并记录相关病史，包括个体临床表型和病程、母亲妊娠史、生长发育史、近亲婚配史、接触史、外伤史、家族史等。结合病史及家系调查资料绘制系谱图。

1.3 模型测量

先证者、1名患者及2名健康对照家庭成员拍摄口内牙列照片及取研究模型保存。取藻酸盐印模，灌制硬石膏模型，对模型完好、萌出完全、形态正常且没有修复体的牙齿，使用电子数显游标卡尺测量其牙冠宽度，测量3次取平均值，并与中国人正常值[11]进行比较。上：上颌;下：下颌。图 1 先证者口内牙列像Fig 1 Dentition photo of proband图 2 先证者全口曲面断层片Fig 2 Panorama of proband图 3 系谱图Fig 3 Pedigree of the family

1.4 头影测量分析

Ⅰ-1、Ⅱ-1、Ⅱ-2拍摄曲面断层片及头颅侧位片，观察对比其颅面及下颌骨形态，并应用Win- Ceph 7.0分析软件对头颅侧位片进行错?畸形类型及特点分析。测量项目分别为SNA角、SNB角、ANB角、Sprime;-Ptmprime;、Aprime;-Ptmprime;、Pogprime;-Goprime;、Cdprime;-Goprime;、下颌平面角、Y轴角、后前面高比、U1-SN、UL-EP、LL-EP、Z角。

1.5 基因筛查

1.5.1 DNA的提取 分别抽取家系内2名先天缺牙患者及2名健康对照家庭成员外周静脉血各5 mL，加入1 mL ACD抗凝，酚-氯仿抽提法进行基因组DNA的提取。

1.5.2 引物设计与合成 根据PAX9和MSX1在Genebank中的全序列设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PAX9基因扩增其第1～4外显子，MSX1基因扩增其1～2外显子。

1.5.3 聚合酶链式反应 50 mu;L反应体系中加入10times;PCR反应缓冲液

5 mu;L、基因组DNA 3 mu;L、Taq DNA聚合酶2.5 U，并使dNTP终浓度为0.3 mu;molmiddot;L-1，上下游引物终浓度均为0.3 mu;molmiddot;L-1，MgCl2浓度为2 mmolmiddot;L-1。反应条件为：在FTC2000 PCR仪上94 ℃预变性3 min后进行以下热循环：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s，35个循环。最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5.4 PCR产物纯化及DNA序列测定 将PCR产物经电泳分离，切取相对分子质量为预期大小的DNA条带，用胶回收试剂盒回收，以去除PCR引物、酶和其他杂质。然后以回收纯化的PCR产物为模板，采用BigDye四色荧光测序反应试剂盒，按试剂盒说明书在9600型PCR仪上进行测序反应，反应的条件为：98 ℃变性2 min，96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 2 min，25个循环。反应结束后在ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪上进行序列测定，测序结果在DNAstar软件中进行编辑和比较。

1.5.5 突变分析 测序结果在Genebank上与人类基因组PAX9基因序列进行同源序列比较，根据系谱图和测序结果进行突变分析。

2 结果

2.1 模型测量结果

先证者和患者伴有更多牙齿形态畸形，牙冠宽度较小。而2名健康对照家族成员仅上颌切牙出现牙齿形态畸形，冠宽较小，余牙基本无异常。

2.2 头影测量分析结果

Ⅲ-1与Ⅱ-2均为骨性Ⅰ类错?畸形，Ⅱ-1为骨性Ⅱ类错?畸形。Ⅱ-1与Ⅱ-2下颌骨长度发育均不足，Ⅲ-1下颌体也稍小。Ⅲ-1为低角倾向，Ⅱ-1与Ⅱ-2为高角倾向。Ⅲ-1 Y轴角减小，表明下颌前突，面部生长方向水平;Ⅱ-1与Ⅱ-2正常。Ⅲ-1为平均生长型趋势，Ⅱ-1与Ⅱ-2为垂直生长型趋势。Ⅲ-1与Ⅱ-2下唇均在E线前且Z角增大，表明唇较前突，而Ⅱ-1正常。提示Ⅲ-1在骨面型及颌骨形态等方面并无明显遗传倾向，但与父母相似的是，下颌发育相对较差。

2.3 基因筛查结果

Ⅲ-1和Ⅱ-2的PAX9外显子3第718位点由G变为C，属错义突变，导致与之对应的第240位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸;MSX1未见突变。家系中Ⅱ-1的测序结果与NCBI Genebank公布的序列一致。

3 讨论

本研究的病例是单纯性多数前牙缺失，无前磨牙和磨牙缺失，表型较特殊。在表型与基因型的关系上，支持和肯定了PAX9基因突变不仅与磨牙缺失相关，可能还与其他牙位缺失相关[8];提示MSX1可能与前牙缺失无关，从另一方面支持和肯定了MSX1与前磨牙缺失相关的理论[5-9]。本例A240P突变的检出再次证实了多数牙先天缺失可能与PAX9基因外显子3的第718位点上的突变有关[6-10]。Pereira等[6]研究表明，A240P突变有可能对PAX9蛋白质的结构造成影响，但并不是所有A240P突变都能引起多数牙先天缺失，即正常人群中也可能存在这种情况，其结果显示A240P与先天缺牙无明显联系，但已证实A240P纯合突变与第三磨牙的缺失密切相关。但本例先证者为A240P纯合突变，却有第三磨牙牙胚存在。因此A240P突变是否为该种缺失的特定因素，不同人种之间是否存在差异，基因型与表型是否存在相关性，有待于收集更多患者，扩大样本量进行相关分析。迄今为止，多项研究都认为，在牙齿发育过程中先天缺牙并非独立的异常现象，而是受遗传因素影响的与牙齿形态、大小等相关的生物学共变因素之一[4，12]。

【参考文献】

[1] Das P, Stockton DW, Bauer C, et al. Haploinsufficiency of PAX9is associated with autosomal dominant hypodontia[J]. Hum Genet,2002, 110：371-376.

[2] Jumlongras D, Lin JY, Chapra A, et al. A novel missense mu-tation in the paired domain of PAX9 causes non-syndromic oli-godontia[J]. Hum Genet, 2004, 114：242-249.

[3] Muller TP, Hill IN, Peterson AC, et al. A survey of congenitallymissing permanent teeth[J]. J Am Dent Assoc, 1970, 81：101-107.

[4] Stockton DW, Das P, Goldenberg M, et al. Mutation of PAX9 isassociated with oligodontia[J]. Nat Genet, 2000, 24：18-19.

[5] Frazier-Bowers SA, Guo DC, Cavender A, et al. A novel muta-tion in human PAX9 causes molar oligodontia[J]. J Dent Res,2002, 81：129-133.

[6] Pereira TV, Salzano FM, Mostowska A, et al. Natural selectionand molecular evolution in primate PAX9 gene, a major deter-minant of tooth development[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103：5676-5681.

[7] Nieminen P, Arte S, Tanner D, et al. Identification of a non-sense mutation in the PAX9 gene in molar oligodontia[J]. Eur JHum Genet, 2001, 9：743-746.

[8] Matalova E, Fleischmannova J, Sharpe PT, et al. Tooth agene-sis： From molecular genetics to molecular dentistry[J]. J DentRes, 2008, 87：617-623.

[9] Kim JW, Simmer JP, Lin BP, et al. Novel MSX1 frameshiftcauses autosomal-dominant oligodontia[J]. J Dent Res, 2006, 85：267-271.

[10] Marla JFO. Muscle segment homeobox, drosophila, homolog of 1;MSX1[EB/OL]. [2006211220]. http：//www.ncbi.nih.gov/Omim/.

[11] 皮昕. 口腔解剖生理学[M]. 6版. 北京： 人民卫生出版社, 2007：41.PI Xin. Oral anatomy and physiology[M]. 6th ed. Beijing： People′sMedical Publishing House, 2007：41.

[12] Kangas AT, Evans AR, Thesleff I, et al. Nonindependence ofmammalian dental characters[J]. Nature, 2004, 432：211-214.

编辑老师为大家整理了口腔医学生毕业论文，供大家参考。更多详情请点击医药学论文。