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作者：王旭凯 王英 杨有庚 冷向阳

【摘要】 [目的]探讨鹿茸多肽对β?淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用。[方法]体外进行胎鼠脊髓神经元细胞培养传代，细胞进入对数生长期后进行实验。MTT比色法检测不同浓度β?淀粉样蛋白作用24 h后细胞活力变化;检测25μmol/L β?淀粉样蛋白作用24 h后，细胞凋亡百分数和观察细胞caspase?3表达情况。[结果]不同浓度的β?淀粉样蛋白作用24 h后对细胞活力均明显下降，并呈剂量依赖性(P<0.05);鹿茸多肽可明显抑制β?淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡现象(P<0.05)，且可使caspase?3的表达量下降。[结论]鹿茸多肽通过抑制β?淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞caspase?3表达增高而对其细胞凋亡发挥保护作用，本实验为探索新的治疗脊髓神经损伤的药物提供了重要的理论基础。

【关键词】 鹿茸多肽 脊髓神经细胞 细胞凋亡 β?淀粉样蛋白 casepase?3

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是外科常见的创伤，其年发病率逐年升高。在脊髓损伤中，除了原发的物理打击因素造成神经细胞损伤外，已发现损伤区及临近部位的神经细胞存在迟发性的死亡现象，这种死亡与常见的坏死不同[1]，表现为一种程序性死亡(细胞凋亡)，细胞凋亡可能参与了脊髓损伤的病理生理过程。caspase?3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，降低其的表达有助于脊髓损伤的修复和再生[2]。鹿茸系鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角[3]。关于鹿茸多肽混合物，近两年，有学者通过实验证明鹿茸多肽对脊髓损伤后的神经细胞有保护作用[4]，本实验应用鹿茸多肽作用于β?淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡的保护作用，以进一步阐述其对脊髓神经细胞保护作用的机理。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料 15d孕鼠购自吉林大学实验动物中心;DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自invitrogen公司;细胞培养瓶和培养板购自Castar公司;神经生长因子(NGF)购自Sigma公司;鹿茸多肽由长春中医药大学惠赠;β?淀粉样蛋白(Aβ25-35)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自(Sigma公司);兔多克隆caspase?3抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 凝聚态Aβ25-35的制备 用超纯水将冻干的Aβ25-35溶解配成100 μmol/L的储存液，于-20℃ 保存，使用前配成所需浓度，于37℃孵育24 h备用。

1.2.2 胎鼠脊髓细胞悬液制备及培养 取孕15d大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉后，无菌状态下取出胎鼠。用Hank’s液冲洗数遍后，放于培养皿中。在解剖显微镜下从背侧完全暴露脑干以下整条脊髓，从正中沟处用钨丝针切除双侧脊髓的后外侧部。将取下的脊髓腹侧组织，经Hank’s液冲洗后，剥去表面的血管等，用显微剪子细剪切成糜状，越细越好;然后用0.25%胰酶37℃消化20min后，用吸管轻轻吹打数次，经200目滤网过滤，离心弃上清，用含15%胎牛血清培养基以1×106/ml接种于塑料培养瓶中。

将细胞培养在含15%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素及100U/ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃、饱和湿度、5 %CO2浓度下培养，2～3d 换液一次。实验均取对数生长期细胞，实验前12 h细胞换用无血清培养液，观察不同浓度Aβ25-35的作用。

1.2.3 MTT比色法检测细胞活力 观察不同终浓度(0、5、10、20、25、30μmol/L)的Aβ25-35作用24 h后，细胞活力的变化，细胞接种于96孔板24 h后加入不同浓度的Aβ25-35作用24 h，每个浓度设4个复孔L，同时设与实验孔平行的空白对照，最后比色时以对照孔调零。共同孵育24 h后更换培养基，每孔加入180μl的培养基和20μl的MTT(5 mg/ml)，置37℃、5%CO2培养箱培养4 h，弃培养液，每孔加入200μl DMSO，37℃孵育30 min，至结晶物充分溶解。在多功能酶标仪上测定570nm的吸光度(D570)，其与对照吸光度的比值作为相对细胞活力。

1.2.4 流式细胞仪检测 将细胞接种于24孔板，待达到80%融合时，按下列分组进行实验：A.对照组，B. Aβ25-35(25μmol/L)，C. Aβ25-35(25μmol/L)+鹿茸多肽(400mg/ml)[3]，D.照射Aβ25-35(25μmol/l)+NGF(20ng/ml)组。各组均6复孔。将24h以后各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min 离心5min，弃上清;用500μl 5mmol/L EDTA/0.01mol/L PBS洗涤细胞;再加入50μl 10g/L RNaseA，室温下孵育30min;最后加入500μl 100mg/LPI染色液，旋转混匀，置4℃避光孵育30min后，流式细胞仪测定。

1.2.5 免疫细胞化学染色 将1cm×lcm盖玻片经浸酸及消毒等处理后，放入24孔培养板中，加入10倍稀释的多聚赖氨酸液，置于CO2 孵箱中1h;弃去多聚赖氨酸液，用DMEM培养基洗一次，将各组细胞悬液分别接种于各孔，继续培养24h;弃去原培养液，用37℃预热的0.1mol/L PBS轻洗3次;余按免疫组织化学试剂盒说明操作。

1.3 统计方法 应用统计分析软件SPSS14.0分析数据，数据以均数±标准差(x±s)表示，两两比较采用t检验，P<0.05，有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓神经元细胞的培养及鉴定 单细胞悬液接种后第2d，细胞聚集成团状，第3d出现大量悬浮的neurosphere(约30～60个细胞)，而且neurosphere越来越多。到第7d细胞胞体十分饱满，轮廓清晰，有的细胞可见明显的鸟眼状细胞核，也有的细胞伸出树枝状突起，突起相互连成网络。用神经元特异烯醇化酶(NSE)标记神经元。镜下观察，可见实验组细胞胞体饱满，突起明显并连成网状。见图1。

图1 烯醇化酶(NSE)标记神经元(略)

2.2 MTT比色法检测细胞活力 MTT检测结果显示，不同浓度的Aβ25-35(0、5、10、20、25、30μmol/L)作用24h后，均可引起细胞活力下降，并呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。本实验选择Aβ25-35 25μmol /ml剂量进行后续实验，见图2。

图2 MTT法检测Aβ25-35细胞活力的影响(略)

2.3 流式细胞仪检测结果 以400mg/ml剂量观察鹿茸多肽对Aβ25-35诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用，并用NGF作为对照。结果显示，Aβ(25μmol/L)+鹿茸多肽(400mg/ml)组细胞凋亡百分数是19.35±6.74与Aβ组凋亡百分数37.42±12.55比较，有显著性差异，P<0.05，其作用与Aβ(25μmol/L)+NGF阳性对照组凋亡百分数17.88±5.91比较无差异。见图3、表1。

表1 鹿茸多肽对Aβ诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用(略)

图3 鹿茸多肽对Aβ诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用(略)

2.4 免疫组化检测caspase?3结果 caspase?3阳性细胞胞质着棕色。结果显示：对照组无caspase?3阳性染色的细胞;Aβ(25μmol/L)+鹿茸多肽(400mg/ml)组caspase?3阳性细胞数减少，比单纯Aβ(25μmol/L)组少，其作用与NGF阳性对照组比较无差异，鹿茸多肽对脊髓细胞凋亡具有抑制作用。见图4。

a 对照组b Aβ组(25μmol/L)c Aβ(25μmol/L)+鹿茸多肽(400mg/ml)d Aβ(25μmol/L)+NGF(20ng/ml)

图4 鹿茸多肽对Aβ(25μM)诱导脊髓神经元细胞caspase?3的表达的影响(略)

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