3.1 OC形态观察 新生大鼠机械分离的细胞数量较多，均匀平铺。培养1h后，大部分未贴壁细胞被M199冲走，此时可见到玻片上多核OC。4h后细胞形态清晰，表面有微绒毛，呈伪足样运动，细胞外形不断变化，部分细胞之间纤维样突出连接(图1)，随着培养时间的延长，细胞充分伸展，体积变大，核仁清晰可见。但培养24h后，大部分OC细胞壁增厚，核固缩，微绒毛消失。含1,25(OH)2D3诱导剂的大鼠骨髓细胞悬液接种于培养板后，4h见细胞均匀分布于培养板底部，呈短梭形贴壁生长。诱导培养6d时，可见体积较大、多核(3～10个)的OLC，呈圆形、多角型等多种形态，时有细胞突起向外延展，胞质密度较低，细胞核或集聚在细胞中央，或散在细胞周边，核内可见1～2个核仁不等(图2)，周围的单核细胞不断融合在较大的OCL中，细胞核逐渐增多，与机械分离培养4h的OC相似。随着培养时间的延长，OLC数量递增，8d时达峰值，后期细胞开始空泡变性，细胞裂解碎片增加，细胞核呈现固缩、碎裂，细胞膜破裂，细胞死亡。

3.2 TRAP 染色 TRAP染色是鉴定OC的特异性酶学染色方法，TRAP染色阳性(TRAP+)为：细胞质染成红色或酒红色，细胞核不着色。机械分离的细胞培养4h后可见到典型的TRAP+的OC，培养8h、10h与4h相比较TRAP+的OC数量没有显著差别(P>0.05)(见表2)，但到10h时OC细胞萎缩，空泡变性明显(图3)。诱导培养第6d开始，可见多核TRAP+细胞，之后TRAP+的细胞逐渐增多，出现较大型的多核细胞，并在第8d数量达到高峰(图4)，与其它时间组差异明显(P<0.01)，11d时TRAP+细胞减少，细胞着色逐渐变淡，颜色转晦暗，第14天TRAP+细胞完全消失。(见表3)

图1 机械分离培养 4h，表面有微绒毛(小箭头)，细胞之间纤维样突出连接(大箭头)。(倒置显微镜×200) (略)

图2 诱导培养第6天，单核细胞之间，出现体积较大、多核OLC(箭头)。(倒置显微镜×400)(略)

图3 机械分离培养 10h，TRAP染色阳性，OC空泡变性(小箭头)。(TRAP染色×200) (略)

图4 诱导培养第8天，TRAP染色阳性的多核细胞(燕尾箭头)，单核细胞核增多，体积增大(三角箭头)，TRAP+的单核细胞(白色箭头)。(TRAP染色×200)(略)

表1 各基因引物序列及片段大小(略)

表2 机械分离法不同时间TRAP+ 细胞个数(略)

不同培养天数之间比较P>0.05

表3 不同诱导天数TRAP+ 细胞个数(略)

不同培养天数之间比较,※P>0.05,△P<0.05,▲P<0.01

3.3 骨吸收功能观察 骨片上吸收陷窝是OC骨吸收的直接结果，其陷窝数量、大小和深度直接反应OC骨吸收的能力。机械法培养24h的骨片甲苯胺蓝染色后，在光镜下可见吸收陷窝呈蓝紫色圆形、椭圆形、腊肠形等多种形态(图5)，边界清楚，部分出现穿凿样改变。而诱导培养8d时，在骨片上发现少量呈蓝紫色小陷窝，随着诱导时间的延长，陷窝的数量、深度均增加，12d时可见大量的吸收陷窝(图6)。经扫描电镜观察可清楚识别骨吸收陷窝，成熟的OC骨吸收陷窝较OLC深，底面粗糙，可见有纤维样基底(图7)，但是相同面积大小的骨片上，诱导12d的骨陷窝数量明显多于机械法。机械法培养24h的骨吸收陷窝比诱导培养8d形成的骨陷窝面积略多，但远少于诱导12d形成的骨吸收陷窝面积。同时机械法产生的吸收陷窝的个数多于诱导8d，远少于诱导12d的数量。(见表4)

表4 不同培养条件骨陷窝的个数(个)和陷窝面积(略)