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作者：杜文喜 肖鲁伟 吴承亮 厉驹 童培建

【摘要】 [目的]探讨不同方法培养下的大鼠破骨细胞(osteoclast，OC)骨吸收功能的差异，以及骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA表达水平的差异，为体外实验奠定基础。[方法]机械分离和诱导培养，即从新生24h的大鼠长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1,25(OH)2 D3诱导大鼠骨髓细胞形成破骨样细胞(osteoclast like cell，OLC)，对获得的OC进行形态和骨吸收功能观察，并测定OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA表达水平的差异。[结果]OC和OLC均为抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色阳性的多核巨细胞，与细胞共培养骨片上可形成骨吸收陷窝;诱导法培养出的OLC数目多于机械分离法，但诱导早期陷窝较之小而浅，诱导后期基本接近OC;OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA，在机械分离8h与诱导培养6天的细胞表达量无显著差异，但都远少于培养8天的表达量。[结论]诱导法可以培育出大量的OLC，优于机械分离法，但早期骨吸收功能较弱，OC骨吸收功能与其核数相关。后期的OCL与机械分离OC接近，可以用于各类实验。

【关键词】 破骨细胞 破骨样细胞 骨吸收 ATPase a3

破骨细胞(osteoclast，OC)是骨吸收的执行细胞，OC骨吸收机制研究对阐明骨组织生理病理机制和代谢性骨病的防治具有十分重要的意义，然而OC为高代谢的分化终末细胞，组织含量极少又非常脆弱，自 Chambers首次建立OC体外培养的方法以来，各国学者不断完善，李氏等在国内首次建立了骨髓细胞诱导培养法，建立了破骨样细胞(osteoclast like cell，OLC)培养体系，发现OLC和OC是同一种细胞[1?2]。OC的骨吸收功能以及形成的数目，是其活性的集中体现，同时，ATPase a3基因是骨吸收功能执行的关键基因，该基因的缺乏或突变，是骨吸收障碍发生骨硬化症和胚胎致死的关键原因[3]。本实验在经典的机械分离法和骨髓细胞诱导培养法的基础上加以改进，对其形态、分化及功能进行了动态观察，测定OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA表达水平量，探讨不同方法培养下的OC骨吸收功能的差异。

1 材料

1.1 动物 新生24h内SD大鼠乳鼠，4周龄SD雄性大鼠(SPF级)，由浙江中医药大学实验动物中心提供[SCXK(沪)2003?0003]。

1.2 主要试剂 M199培养基、α?MEM培养基、HEPES液(美国Gibco公司)，1,25(OH)2D3、萘酚AS?BI磷酸盐(美国Sigma 公司)，甲苯胺蓝(瑞士Fluka公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)，Trizol、引物合成(美国Invitrogen公司)，M?MLV 逆转录酶(美国promege公司)。

1.3 盖玻片及骨磨片的制备 将10×10mm盖玻片，经硫酸-重铬酸钾清洗液中过夜，蒸馏水超声波清洗，自然晾干，高压消毒后备用。取新鲜成年牛股骨皮质骨，锯成厚骨片，经角磨机和细金刚砂纸磨至约15μm厚，再剪成5×5mm大小，三蒸水中超声波清洗后，自然晾干，使用前紫外线双面照射各4 h。

2 方法

2.1 大鼠OC机械分离法培养 参考文献[4]方法操作，培养1h后再用培养液冲洗，分别于4、8和10h取出盖玻片进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色，8h时抽提OC总RNA，并将与OC共培养24h的骨片甲苯胺蓝染色。

2.2 大鼠骨髓细胞诱导法 选用4周龄SD雄性大鼠，断颈处死，无菌条件下分离完整股骨、胫骨，暴露髓腔后用α?MEM培养基(含20%胎牛血清)冲洗骨髓腔数次至骨干发白为止。冲洗液200目筛网过滤后，收集液接种于25ml培养瓶，标准培养(饱和湿度、5% CO2、37℃) 1h后收集上层细胞液(含骨髓单核细胞)，500 r/min，4℃离心5 min，弃上清，用完全培养基(含20%胎牛血清、1×10-8mol/L的1,25(OH)2D3、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的α?MEM培养基)稀释细胞至1.5×106个/孔，将细胞悬液加入预置盖玻片或牛骨片的进口24孔细胞培养板。常规培养，每3 d换液1次，每次换总量的一半。培养全过程中，动态观察细胞的形态和生长状态，分别于3，6，8，11，14d取出盖玻片进行TRAP染色，抽提6d和8d的OLC总RNA，并将8d、12d与OLC共培养骨片甲苯胺蓝染色。

2.3 OC的形态观察 分别对不同方法培养的细胞进行观察，TRAP染色。将待定培养时间的细胞爬片取出，按照文献[4]方法与步骤进行染色，甘油明胶封片，光镜观察。其中诱导培养法中的OLC含2个胞核以上且呈TRAP染色阳性的细胞即为OC。在200倍光镜下进行OC计数，每个玻片上随机选择10个视野，计数阳性细胞均值并做统计。

2.4 骨吸收功能观察 分别取与上述细胞共培养的骨片，经2.5%戊二醛溶液固定、0.25mol.L-1氢氧化铵中超声波清洗，系列酒精脱水，自然晾干，1%甲苯胺蓝染色，观察骨片上骨陷窝形态并拍照，利用计算机图像分析系统计算整张骨片上骨吸收陷窝面积之和，结果以陷窝面积/片(mm2/片)表示。通过骨片上吸收陷窝的面积变化情况，进一步鉴定两种OC体外培养体系差异。并将观察后的骨片用2.5%戊二醛和1%四氧化锇各固定，酸性二钾氧基丙烷梯度脱水，丙酮清洗，CO2临界点干燥，镀金，制备电子显微镜标本。

2.5 RT?PCR半定量分析 Trizol法提取细胞总RNA，取1μg 总RNA采用两步法RT?PCR。ATPase a3基因[5]与内参甘油醛3?磷酸脱氢酶(glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase, GAPDH)引物(见表1)。PCR反应条件为：94℃ 30sec，61℃(GAPDH 60℃)30sec，72℃ 1min。取扩增产物各10μl在1.7%琼脂糖凝胶电泳，用Image?pro plus 6.0软件对扩增产物进行密度值分析，分别计为DATPase a3、DGAPDH，DATPa

se a3 / DGAPDH表示ATP a3 mRNA的相对含量。

2.6 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件包进行统计。各组数据采用x±s表示，计量资料比较用单因素方差分析(one?way ANOVA)。以P<0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异。

3 结果