不同培养时间之间比较△P<0.05、▲P<0.01。

3.4 两种方法ATPase a3的表达变化 ATPase a3基因经RT?PCR扩增，1.7%琼脂糖凝胶电泳(图8)，发现机械分离8h目的基因扩增产物密度值少于诱导培养8d，差异明显(P<0.01)，但与诱导培养6d无差异(P>0.05)，而且相对密度值同样少于诱导培养8d。(见表5)

图5 机械分离培养24h，与OC共培养的骨片，出现较周围骨组织深染的骨陷窝，腊肠形骨质吸收区(箭头)。(甲苯胺蓝染色×150)(略)

图6 诱导培养12d，与OLC共培养的骨片，出现大量骨陷窝，斑片状骨质吸收区(箭头)。(甲苯胺蓝染色×150)(略)

图7 机械分离培养24h，与OC共培养的骨片，骨吸收陷窝较深呈现呈不规则形，边界清晰、底面粗糙不平(箭头)。(扫描电镜×150)(略)

图8 RT?PCR产物，ATPase a3基因mRNA表达量，诱导法8d较其它时间段多。(略)

表5 不同时间段RT?PCR产物密度值(略)

不同组间比较，※P>0.05，△P<0.05，▲P<0.01

4 讨论

OC是高度分化的多核巨细胞，直接参与骨吸收，是骨组织吸收的主要功能细胞。目前，多数学者认为OC来源于单核/巨噬细胞前体细胞[6?7]，到目前为止尚缺乏成熟的OC细胞株，因此机械分离法是最直接最有效获得成熟OC的方法。根据OC体形巨大、能迅速粘附于基质的特点，本研究在原机械分离方法上改进，培养1h后再用培养液冲洗，以除去大量未贴壁的细胞，达到相对纯化的目的。24h动态观察发现，8～10h最典型，胞核清晰，细胞饱满，丝状足

密集，呈伪足样运动、TRAP阳性等特点，12h细胞开始凋亡，24h典型细胞形态完全消失，机械分离法培养的OC含量少又非常脆弱，成为其生化学和分子生物学研究的严重限制因素。

由骨髓和其它组织诱导培养形成的细胞与成熟的OC来源不同，称为OLC[2]。课题组用1,25(OH)2 D3成功地在体外诱导SD大鼠骨髓细胞分化形成OLC，发现在1×10-8mol.L-1 1,25(OH)2 D3的作用下，骨髓细胞可形成大量的TRAP+、在骨片上形成陷窝的多核巨细胞，与文献报道一致[1]。1,25(OH)2D3为VitD生物活性最强的代谢产物，与成骨细胞(osteoblast, OB)的1,25(OH)2D3受体结合，上调破骨细胞分化因子(receptor activator of NF?κB Ligand, RANKL)，直接刺激多核OC的分化成熟，同时可促使OB分泌粒细胞集落刺激因子(M?CSF)，间接促进OC形成[8]。骨髓中的破骨前体细胞在诱导因子的作用下逐渐向OC分化，实验显示OCL骨吸收数目、面积逐渐增多，活力逐渐增强。1,25(OH)2 D3诱导出的OLC数量明显多于机械分离的方法，且OCL周围的单核细胞逐渐不断融合，形成更大的OCL，细胞核逐渐增多，早期细胞核多于5个的OLC数量总体上少于机械分离OC的数量，但晚期多核OCL明显增多，且存活时间远长于机械分离的成熟OC。机械法骨吸收陷窝边界清楚，部分出现穿凿样改变，而诱导法从出现少量小陷窝到陷窝的数量、深度逐渐增加。虽然诱导培养OLC依赖骨髓细胞中的OB和OC前体细胞来实现的，很难分离到纯的OC，还有待于进一步改善方法提高其纯度，但是诱导法培养法明显优于机械分离法。

Atpase a3基因产物为分子量116 KDa的蛋白(a3)，是OC空泡型质子泵(空泡型氢离子三磷酸腺苷转运酶Vacuolar H+?translocatiing，ATP?ase，简称V?ATPase) 跨膜部分之一，V?ATPase活化后将H+分泌到细胞外而完成骨吸收功能。李亦平等[9]克隆了小鼠该基因，并制备出该基因缺失的小鼠，该小鼠的OC数目正常，可附着在骨上，但不能形成吸收陷窝;破骨样多核细胞不能形成细胞外酸化腔，也不能使骨去矿物化;OC失去细胞外酸化功能，使小鼠出现严重的骨质硬化。同时Niikura[3]也表明ATPase a3对OC发挥骨吸收功能是必需的，该基因的突变是婴儿恶性骨硬化病发生及胚胎致死的关键原因[10]。利用OC噬骨形成吸收陷窝特性，观察陷窝的形态和测量陷窝的数量、大小、深度，以及Atpase a3基因表达量是检测OC骨吸收功能的可靠指标。

RT?PCR实验证实，经机械分离培养后，相对数量少的成熟的OC骨吸收关键基因ATPase a3表达量较诱导早期(6d)OLC多，而少于8d的OLC，由此可知细胞核数与OC骨吸收功能直接相关，与Manolson[11]报道一致，其研究发现a3亚基的表达随破骨细胞核数(2～5,6～9和≥10)的增多而逐渐增加，a3 mRNA在大破骨细胞中比在小破骨细胞中高2.5倍，而a3是V?ATPase的关键性亚基，由ATPase a3基因调控，是功能性破骨细胞的必需成分，可见诱导培养的早期OLC可能并未达到完全分化且胞核数少，因而在骨片上形成的吸收陷窝较小，后期多核OCL逐渐增多，陷窝的数量、深度逐渐增加，基本接近成熟的OC。由此可知：机械分离培养法，可简单有效的获得骨吸收功能较活跃的OC，但存活时间短不利于进行长期生化和分子生物研究，且需要牺牲大量的动物;而1,25(OH)2D3诱导法可以获得数量多且生存时间较长的OCL，因此更适合用于OC分化发育过程的研究以及关键基因的转基因筛选应用。同时OC的骨吸收功能与其核数直接相关，机械分离下来的细胞为胞核多的成熟OC，骨吸收功能强于胞核较少的早期OLC，单核细胞逐渐不断融合，形成更多、更大的OCL，诱导晚期的OCL数量和功能上完全可以替代成熟OC进行各类实验。

OC功能异常导致骨改建平衡失调，是多种代谢性骨病的病理基础，1,25(OH)2D3诱导法成功的建立OCL培养体系，替代机械分离成熟OC方法，建立较为稳定的实验平台，为利用分子生物方法高效特异的抑制OC的骨吸收功能奠定基础，能有效的纠正绝对或者相对旺盛的骨吸收功能状态，达到恢复骨吸收、重建动态平衡，就可以有效防治如骨质疏松症、Paget’s病、激素性股骨头坏死、风湿性关节炎、肿瘤、牙周病等疾病，因此具有广阔的基础研究和临床应用前景。

【参考文献】