1.2.8细胞超微结构的观察各组细胞转染重组质粒以及加入阿霉素共培养48 h以后，消化收集各组细胞沉淀,戊二醛固定细胞,染色后进行透射电镜观察.

统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析. P<0.05为差异具有统计学意义.

2结果

2.1重组质粒的构建和鉴定如图1所示，重组质粒被SalⅠ酶切出一条约400 bp的DNA小带. 三条Livin的干扰质粒和si?HK均符合设计要求. 测序结果均与目的序列相同.

1: si?HK SalI酶切; 2: si?HK; 3: si?Livin1 SalI酶切; 4: si?Livin1; 5: si?Livin2 SalI酶切; 6: si?Livin2; 7: si?Livin3 SalI酶切; 8: si?Livin3; M: marker.

图1重组质粒的酶切鉴定

2.2Livin?siRNA对Livin表达的下调作用转染48 h后，与未转染组比较，Livin表达在si?HK组和脂质体组无明显变化(P>0.05)，si?Livin1组，si?Livin2组，si?Livin3组的Livin mRNA和蛋白表达受到不同程度的抑制，其中si?Livin2组的Livin表达抑制最明显，其抑制率分别约76.4%和70.2%(P<0.05，图2).

1: 未转染组; 2: si?HK组; 3: 脂质体组; 4: si?Livin1组; 5: si?Livin2组; 6: si?Livin3组.

图2Western Blot检测Livin表达水平

2.3Livin?siRNA对Caspase?3表达的影响转染48 h后，未转染组，si?HK组和脂质体组的Caspase?3表达无明显差异(P>0.05)，si?Livin2组Caspase?3 mRNA和蛋白相对含量比未转染组升高157.1%和38.6%(P<0.05，图3).

1: 未转染组; 2: si?HK组; 3: 脂质体组; 4: si?Livin2组.

图3Western Blot检测Caspase?3表达水平

2.4Livin?siRNA对MDA?MB?231细胞增殖以及阿霉素IC50的影响如图4所示，转染si?Livin2沉默Livin表达后对细胞增殖具有抑制作用，si?Livin2组生长曲线较未转染组和si?HK组平缓. si?Livin2组细胞对阿霉素IC50值较未转染组和si?HK组下降显著，分别为(2.46±0.87)，(7.13±0.68),(7.24±0.53) mg/L，差异具有统计学意义(P<0.05，图4).

图4Livin?siRNA对MDA?MB?231细胞增殖的抑制作用

2.5Livin?siRNA联合阿霉素对MDA?MB?231细胞周期的影响G0/G1期细胞比率阿霉素组细胞与未转染组和si?HK组细胞相比较有所升高(P<0.05);S期细胞比率降低(P<0.05);而si?Livin2联合阿霉素干预组细胞周期阻滞于G0/G1期更加显著，差异具有统计学意义(P<0.05，表1).表1各组MDA?MB?231细胞周期的变化

2.6TUNEL法检测Livin?siRNA增强MDA?MB?231对阿霉素敏感性在单独加入阿霉素干预时，可见到胞质为棕黄色的凋亡细胞，其凋亡率为(21.62±1.38)%，高于未转染组的(2.62±1.18)%(P<0.05);si?Livin2与阿霉素联合干预后，细胞凋亡率为(38.35±2.64)%，较未转染组和si?HK组的凋亡细胞增加更加显著(P<0.05，图5).

2.7MDA?MB?231细胞超微结构的观察透射电镜下观察可见,si?Livin2联合阿霉素组MDA?MB?231细胞胞体缩小，胞质浓缩、胞膜崩解，部分线粒体肿胀，核仁消失、染色质聚集浓缩为数个团块,电子密度增高. 而未转染组和si?HK组细胞未见此类表现(图6).