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作者：李凡 王小毅 田甜 陈力 李佳 任国胜

【摘要】 目的： 采用RNA干扰技术下调Livin基因的表达，观察其提高乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性及机制. 方法： 构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDA?MB?231后，通过实时定量PCR，Western Blot技术检测干扰前后Livin和Caspase?3的表达;采用MTT法检测细胞增殖的变化以及细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50)，流式细胞法检测细胞周期，TUNEL法检测其诱导细胞对阿霉素化疗增敏作用，并观察细胞超微结构变化. 结果： 成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体，si?Livin2对Livin的mRNA和蛋白抑制效率最高，分别为76.4%和70.2%，同时Caspase?3的mRNA和蛋白表达升高约157.1%和38.6%(P<0.05). si?Livin2转染48 h后，与未转染组相比，细胞增殖活力受到抑制，si?Livin2联合阿霉素使细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05)，显著提高了细胞对阿霉素敏感性，其凋亡率达到(38.35±2.64)%，IC50降低为(2.46±0.87) mg/L，差异具有统计学意义(P<0.05). 透射电镜下可见细胞胞质浓缩，染色质聚集为小团块，电子密度增高. 结论： 靶向Livin siRNA真核表达载体可以有效地下调MDA?MB?231细胞Livin基因的表达，并且通过上调Caspase?3的表达抑制细胞增殖，显著增强其对阿霉素的敏感性.

【关键词】 乳腺肿瘤;Livin基因;RNA干扰;阿霉素

0引言

Livin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员，它在肿瘤组织中特异性表达并具有强大的抗凋亡作用，已成为肿瘤基因治疗新的靶点[1]. 近年的研究[2]认为，凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，IAP家族在调节肿瘤细胞对凋亡敏感性方面起着核心作用. 而特异性阻断肿瘤细胞内高表达的Livin基因，可以抑制细胞增殖并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[3]，但其化疗增敏作用的发生机制尚不明确. 我们通过构建靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDA?MB?231，观察Livin表达下调对细胞阿霉素化疗敏感性的影响，并探讨其发生的可能机制.

1材料和方法

1.1材料人乳腺癌细胞株MDA?MB?231(中科院上海细胞资源中心);shRNA质粒载体pGeneSil?1(武汉晶赛公司);LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司);质粒提取试剂盒(美国Omega公司);总RNA提取试剂、实时定量PCR扩增试剂(大连TaKaRa公司);兔抗人多克隆抗体Livin(美国Imgenex公司);兔抗人多克隆抗体Caspase?3，辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司);TUNEL检测试剂盒(德国Roche公司).

1.2方法

1.2.1靶向Livin的siRNA真核表达载体的构建利用Ambion公司在线设计程序，针对GenBank中Livin(No.NM?022161，No.NM?139317)的共同序列，筛选出三条干扰序列，即siRNA1：5′?CTGGCCTCCTTCTATGACT?3′;siRNA2：5′?GGAAGAGACTTTGTCCACA?3′;siRNA3：5′?CCGTGTCCATCGTCTTTGT?3′;同时设计非特异性靶序列：5′?GACTTCATAAGGCGCATGC?3′. 将化学合成的正义链和反义链退火，与经HindⅢ和BamHⅠ酶切后线性化的pGeneSil?1载体连接，经筛选，酶切鉴定后测序. 所得质粒命名为si?Livin1, si?Livin2, si?Livin3和 si?HK.

1.2.2MDA?MB?231细胞的培养和转染MDA?MB?231细胞用含100 mL/L胎牛血清、1×105 U/L青霉素和1×105 U/L链霉素的RPMI1640培养液，于37℃，50 mL/L CO2的恒温箱中培养传代. 转染前将细胞接种于6孔板,待细胞生长至密度为70%～90%时，按照LipofectamineTM2000说明书转染重组质粒.

1.2.3实时定量PCR检测细胞接种于6孔板，分为未转染组，si?HK组，脂质体组，si?Livin1组，si? Livin2组和si?Livin3组. 转染48 h后收集细胞，按照试剂说明书提取细胞总RNA. 以cDNA为模板，进行实时定量PCR反应. PCR扩增条件：95℃ 10 s,1个循环;95℃ 5 s，60℃ 31 s，40个循环;95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s,1个循环. 引物序列：Livin，上游：5′?CTGGGACCCGTGGGAAGAAC ?3′，下游：5′?TCCTGGGCACTTTCAGACTG?3′;β?actin，上游：5′?TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA?3′，下游：5′?GTAGCCACGCTCGGTCAGGATCTTC ?3′. 以Livin基因与β?actin相对浓度的比值反映Livin表达量. 检测Caspase?3时，实验分为未转染组，si?HK组和干扰Livin效果最强的si?Livin2组. 引物Caspase?3,上游：5′?AGAACTGGACTGTGGCATTGAG?3′，下游：5′?GCTTGTCGGCATACTGTTTCAG?3′. 检测方法同前.

1.2.4Western Blot检测重组质粒转染48 h后，实验分组同上. 蛋白裂解液提取总蛋白. 用12 mL/L的SDS?PAGE胶垂直电泳分离. 蛋白电转至PVDF膜，封闭后分别加入一抗(1∶500)和辣根酶标记兔二抗(1∶5000)，T?BST漂洗后ECL于暗室中曝光和显影.

1.2.5细胞增殖能力及细胞对阿霉素半数抑制浓度由于si?Livin

2组的Livin抑制率最高，故只用si?Livin2进行干预. ① 将细胞分为未转染组，si?HK组和si?Livin2组(后续实验分组相同). 重组质粒分别转染细胞，培养0,24,48,72和96 h后加入5 g/L MTT 20 μL，37℃避光孵育4 h后加入150 μL DMSO,酶标仪波长490 nm处检测吸光度A值. ② 将不同浓度的阿霉素加入未转染组(即为阿霉素组)和转染48 h后的si?HK组和si?Livin2组(si?Livin2联合阿霉素干预组)，各组阿霉素终浓度分别为1，2，4，6，8，10 mg/L，继续培养48 h，MTT法检测各孔A值. 按照公式计算细胞生长抑制率. 抑制率(%)=(1-转染组A值/未转染组A值)×100%. 以细胞抑制率与阿霉素浓度的数值为依据，求出阿霉素的半数抑制浓度(IC50)值.

1.2.6流式细胞仪检测细胞周期细胞接种于6孔板，转染48 h后，加入阿霉素(终浓度为4.5 mg/L)继续培养48 h;消化收集细胞，用700 mL/L的冰乙醇4℃固定30 min以上. 去除乙醇，加终浓度50 mg/L的RNaseA，室温静置1 h;加入终浓度为100 mg/L的碘化丙啶(propidium iodide, PI)，避光30 min后上机检测.

1.2.7Tunel法检测细胞凋亡细胞接种于置入了细胞爬片的24孔板，转染48 h后，分别在各组加入PBS和终浓度为4.5 mg/L的阿霉素. 继续培养48 h后按TUNEL试剂盒说明书检测细胞凋亡，胞质呈棕黄色的为凋亡细胞. 每张爬片于高倍镜下随机观察5个视野，以凋亡细胞数除以细胞总数作为细胞凋亡率.