B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平实验分为空白组，胎牛血清组，对照血清组，低、中、高剂量含药血清组共6组;在24孔板中培养B16细胞至对数期，药物作用72h后，进行固定、间接免疫荧光法染色。步骤如下：吸弃培养液，滴加0?01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，每次加1mL轻微震荡5min，以下同)冲洗标本3次，体积分数4%甲醛室温固定30min;PBS冲洗10次，50g/L小牛血清白蛋白(BSA)室温下封闭30min，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加用PBS 按1：100稀释的Cx26/30/32一抗，覆盖标本，将样品置于湿盒内，4℃过夜;用PBS冲洗10次，用滤纸吸去多余水分，滴加1：50稀释的荧光二抗(在暗室中进行);湿盒内室温静置2h;用滤纸吸去多余水分，在荧光显微镜高倍视野蓝色激发光下观察。设阴性对照：一组不加一抗和二抗，用于荧光强度的基线校正;一组仅加二抗，用于非特异性结合对照。镜下观察到绿色荧光，说明该处有连接蛋白Cx26/30/32的存在，判定为阳性表达细胞，如无绿色荧光呈现，判定为阴性表达细胞。每个样本随机抽取8个高倍视野(×200)，在盲法摄取图像后，采用盲法评分，根据荧光表达的亮度分为(-)、(+)、(++)、(+++)、(++++)5个等级，具体标准由观察者掌握;计分标准为(-)记0分、(+)记1分、(++)记2分，以此类推。

1?7流式荧光法检测

B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平实验分为空白组，胎牛血清组，对照血清组，低、中、高剂量含药血清组共6组;6孔板中培养细胞至对数生长期，药物作用72h后，流式荧光法检测B16细胞Cx26/30/32表达水平。操作步骤如下：倒弃培养基，PBS洗1次，胰酶消化，离心(12000r/min，以下同);2?5g/L的多聚甲醛固定5min，离心，吸弃甲醛，PBS洗3次;加1：50稀释的一抗，室温孵育1h;离心，弃上清，PBS洗3次;加1：10稀释的荧光二抗，暗室中室温孵育30min，离心，弃上清，PBS洗2次，PBS重悬，流式细胞仪检测，每组10000个细胞。

1?8统计学方法

采用SPSS11?5统计软件分析，多组间比较用One?Way ANOVA?LSD法。

2结果

2?1Western blot技术分析

B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平从图1可见，各组β?actin的含量相当，提示各上样孔中总蛋白量基本相同;而对照血清组和六味地黄丸含药血清组均大于无鼠血清的空白组，说明对照血清和含药血清均可提高Cx26/30/32的表达;但含药血清中、高剂量组Cx的表达明显强于对照血清组，且作用具有量效关系。

2?2间接免疫荧光法检测

B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平镜下观察，各组均有Cx26/30/32表达的阳性细胞，荧光主要集中在胞膜上;空白组和胎牛血清组荧光强度明显弱于对照血清组和六味地黄丸各含药血清组(图2，彩图见第200页)，计分结果与肉眼镜下观察结果较一致(见表1)，秩和检验分析显示含药血清中、高剂量组与空白组比较差异均具有显著性意义(P<0?01)，低、中、高剂量含药血清组提高Cx表达的作用存在量效关系。但与对照血清组比较，高剂量含药血清组荧光强度有所增加，但差异无显著性意义(P>0?05)，含药血清低剂量组Cx蛋白表达反而下降，差异有显著性意义(P<0?01)。低、中、高剂量含药血清组组间两两比较差异均有显著性意义(P<0?01)，说明低、中、高剂量含药血清提高Cx表达的作用存在量效关系。表1各组细胞荧光强度比较(略)

2?3流式荧光法检测

B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平在本试验中，设立了只加二抗组，用于非特异性结合对照。而各组减去非特异性结合对照的结果即是各组10000个细胞的平均荧光光密度值。结果显示各组均有Cx表达的阳性细胞，空白组荧光强度弱于对照血清组和各含药血清组。六味地黄丸低、中、高含药血清组间提高Cx表达的作用存在量效关系，结果与间接免疫荧光法检测结果基本一致(见表2、图3)。表2流式细胞仪检测B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达情况(略)

3讨论