1967年Revel等[8]首次在大鼠心肌细胞间和肝细胞间发现了一种构造精妙的连接方式，并将之命名为“缝隙连接”(GJ)，从此开创了GJ研究的新纪元。生物体内相邻细胞间主要通过GJ通道互相传递信号分子，从而控制细胞间的协调生长。这种由GJ介导的细胞间物质、能量及信息的交换活动称为缝隙连接细胞间通讯(GJIC)。Cx是GJ的结构蛋白，是GJIC的物质基础，Cx的正常或异常表达，可直接影响到细胞、组织及器官的功能状态。Cx是一种整合膜蛋白，6个哑铃形Cx亚单位寡聚化形成单侧膜通道，称连接子(connexon)，相邻细胞的连接子衔接形成细胞间膜通道，即GJ通道，属于跨膜亲水性通道结构[9]。连接子的亚单位可以相同或不同，如此，各种Cx分子在数量和空间上的不同组配可形成多种连接子，不同连接子又相互组配从而形成种类庞多的缝隙连接。Cx属于多基因家族，各家族成员的基因序列具有高度同源性。依据该家族基因编码的蛋白质分子量对各成员进行命名，如Cx26、Cx32等，目前已确认哺乳动物中至少有16种Cx基因[4]。本实验采用Western blot技术检测B16细胞Cx26/30/32蛋白总表达量，结果显示与空白组比较，对照血清和六味地黄丸含药血清均可提高B16细胞的Cx表达，六味地黄丸含药血清组Cx的表达强度明显高于对照血清组，且含药血清的作用具有量效关系。只有细胞膜上Cx才是形成GJ的物质基础，GJIC功能主要取决于整合在细胞膜表面的Cx数量与质量，因而Cx蛋白总表达量的增加并不一定说明Cx介导GJIC功能的增强。本实验中我们用间接免疫荧光法和流式荧光法检测了细胞膜表面的Cx数量(由于在试验中未加入细胞膜穿孔剂，大分子的抗体不能通过细胞膜进入细胞内，因而检测到的Cx主要是细胞膜上表达的含量)。结果显示对照血清组和各含药血清组均有提高B16细胞膜Cx表达的作用;六味地黄丸低、中、高剂量含药血清提高Cx表达的作用存在量效关系。从多批次的实验结果我们均观察到两个有趣的现象。一是10%的对照血清可明显提高Cx蛋白总表达量和细胞膜Cx表达量。由于实验过程中对照血清和各含药血清均是在空白组(完全培养基)的基础上添加了10%的经过灌胃处理的大鼠血清，为了排除培养液中增加的血清量对Cx表达的影响，我们观察了在完全培养基中再加入10%胎牛血清对Cx表达的作用，结果显示10%胎牛血清对Cx表达无增强作用;那么是否血清作用具有种属特异性呢?我们又进一步地观察了10%不灌胃的大鼠血清的作用，也未显示其对Cx表达的增强作用(上述结果未显示)，其结果提示灌胃剌激可促使体内产生某些活性物质，具有促进黑色素瘤B16细胞Cx表达的作用。灌胃剌激促进Cx表达作用的机制有待深入研究，我们推测可能与灌胃剌激引起的应激反应相关。通过查阅文献，有报道冷剌激可上调肾上腺嗜酪细胞Cx表达[10]，但对肿瘤细胞Cx表达的影响未见报道，值得进一步研究。另一有趣的现象是，当含药血清与对照血清按不同比例混合后，六味地黄丸含药血清在低剂量时具有抑制对照血清上调Cx表达的作用，而在高剂量时则又能进一步上调Cx的表达，表明六味地黄丸含药血清对Cx的表达具有双向调节作用，其作用的物质基础和具体机制及意义有待进一步阐明。本研究结果表明，六味地黄丸能调控黑色素瘤B16细胞株的Cx表达，提示六味地黄丸对黑色素瘤自杀基因治疗具有潜在的增效的可行性。研究还表明，GJ功能在放射治疗和化学治疗的增效中也有一定的作用[11-12]，六味地黄丸能调控肿瘤细胞Cx表达，提示该方也有可能具有放、化疗增敏的可能性[13]。六味地黄丸具有广泛的药理作用，在抗衰老、抗肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、中枢神经系统功能紊乱等的治疗中被广泛应用[14-17];Cx表达异常与衰老、肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病的发生发展密切相关[18-21];六味地黄丸疾病治疗谱与Cx表达异常所致的疾病关联性非常强。其对Cx表达的调控作用是否就是其广泛药理作用的分子生物学基础，值得进一步探讨。

【参考文献】