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浅谈六味地黄丸含药血清调控黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用

作者：杜标炎，张小贺，谭宇蕙，吴映雅，易华，郭玉荣

【摘要】 　　【目的】观察六味地黄丸含药血清调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx)表达的作用。【方法】采用SD大鼠灌胃8d制备六味地黄丸含药血清(药物剂量为32g·kg-1·d-1)和对照血清(灌胃等容积生理盐水);选择对B16细胞生长和形态影响不大的血清浓度(体积分数为10%)作为大鼠血清的工作浓度;采用Western blot技术和间接免疫荧光法及流式荧光法检测六味地黄丸含药血清对黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白(Cx26/30/32)表达的影响。【结果】Western blot检测显示空白组(无鼠血清)3种Cx几乎不表达，而对照血清和六味地黄丸各浓度含药血清均能提高Cx蛋白的表达，但含药血清的作用更为明显且有显著的量效关系;间接免疫荧光法和流式荧光法检测显示类似的结果：对照血清组和中、高剂量含药血清组的Cx蛋白荧光强度均较空白组显著增加(P<0?01)，但与对照血清组比较，只有高剂量含药血清组荧光强度显著增加(P<0?05)，低剂量含药血清组Cx蛋白表达反而下降(P<0?01)。【结论】六味地黄丸含药血清具有调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用。

【关键词】 肿瘤/中西医结合疗法;六味地黄丸/药理学;黑色素瘤;基因治疗;肿瘤细胞，培养的

Abstract: Objective To investigate the regulatory effect of medicated serum of Liuwei Dihuang Bolus (LDB) on the expression of connexins (Cxs) in mice melanoma B16 cells.MethodsMedicated serum was obtained from SD rats which were treated with LDB at the dose of 32g·kg-1·d-1 and non?medicated serum was obtained from rats receiving normal saline by gavage for 8 days. The rat serum at the concentration of 10% (V/V) served as the working solution. The expression of connexins (Cx26/30/32) was detected by using western blot method，indirect immunofluorescence assay and fluorescence activated cell sorter (FACS) assay.ResultsThe results of western blot assay showed that Cx26/30/32 was undetectable in the blank group(without use of rat serum)，while the amount of Cx26/30/32 in B16 cells were up?regulated by rat control serum and the medicated serum，the up?regulation of medicated serum being obvious and in a dose?effect manner.Indirect immunofluorescence assay and FACS assay showed similar results: the fluorescence intensity in the groups treated with rat control serum and medicated serums was higher than that in the blank group(P<0?01);the fluorescence intensity in the group of high?dose medicated serum was higher than that in the control serum group(P<0?05)，and Cx expression was decreased in the group of low?dose medicated serum (P<0?01).Conclusion Medicated serum of LDB exerts regulatory effect on the expression of connexins in melanoma B16 cells.

Key words:TUMOR/TCM?WM therapy;LIUWEI DIHUANG BOLUS /pharmacology;MELANOMA;GENE THERAPY;TUMOR CELLS，CULTURED

缝隙连接(gap junction，GJ)是存在于细胞之间进行物质及信息交换的通道，对细胞增殖、分化及机体的生长发育至关重要[1]。近年来研究发现，缝隙连接功能复杂多样，参与许多生理及病理过程;缝隙连接蛋白(connexin,Cx)即为组成GJ通道的结构蛋白，是进行细胞间通讯的物质基础。Cx与肿瘤的发生发展密切相关[2]，被誉为“第二类抑癌基因” [3]。在许多恶性肿瘤细胞中Cx基因异常低表达;有些肿瘤细胞虽能表达Cx，但由于存在Cx不能正常折叠与定位，或Cx相互聚合时排列紊乱等情况，导致不能形成结构完整有序的功能性膜通道[4] 。上述现象使缝隙连接细胞间通讯 (gap junction intercellular communication，GJIC) 功能发生异常改变或减弱。GJIC与肿瘤自杀基因疗法的旁杀伤效应密切相关，GJIC使自杀基因系统的毒性产物能通过GJ通道传导到未转染自杀基因的细胞中而引起旁杀伤效应，是其增效作用的主要机制之一[5]。我们已有的研究结果表明，自杀基因治疗联合补肾方药六味地黄丸在体内和体外均能起到协同增效的作用[6-7]。其增效作用是否与提高肿瘤细胞的Cx表达相关?我们通过本实验进行了初步的研究，现报道如下。

1材料与方法

1?1主要试剂与仪器

RPMI?1640培养基为Gibico公司产品;新生牛血清为TBD公司产品;3?(4?5?二甲基?2?噻唑)?2?5?二苯基溴化四唑(MTT)、二

甲基亚砜(DMSO)、丙烯酰胺、β?巯基乙醇、苯甲基磺酰氟(PMSF)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等试剂均为Sigma公司产品;Cx26/30/32一抗为兔抗鼠多抗，为美国Santa cruz公司产品;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔荧光二抗、HRP?ECL发光液为美国KPL公司产品;2? 2?联喹啉?4? 4?二甲酸二钠(BCA)蛋白质定量检测试剂盒为申能博采生物科技有限公司产品;细胞培养瓶、培养板、冻存管、滤膜等均为美国Corning公司或丹麦Nunc公司产品;硝酸纤维素膜为Pall公司产品。BNA?311型CO2培养箱(日本Espec);Extra型流式细胞仪(美国Coulter Co?Ltd);IX71?F22FL/PH型荧光倒置显微镜(日本Olympus);Syngene GeneGenius 型凝胶成像系统(Syngene);20型聚丙烯酰胺凝胶蛋白垂直电泳系统(SDS?PAGE)和转膜系统(Bio?Rad)。

1?2细胞株小鼠恶性黑色素瘤B16细胞株购于中山大学动物中心细胞库。

1?3实验动物SD大鼠，体质量 230～280g，雄性，健康，清洁级,合格证号SCXK(粤)2003?0001，粤监证字2006A014;环境合格证号NO 0010470，由广州中医药大学实验动物中心提供。

1?4六味地黄丸含药血清和对照血清的制备及血清对细胞生长的影响[8]选用16只SD大鼠随机分为2组，对照血清组灌胃生理盐水，六味地黄丸含药血清组灌胃六味地黄丸(剂量为32g·kg-1·d-1)，连续灌胃8d，分别制备对照血清和含药血清，-70℃冰箱保存备用。MTT法检测各浓度对照血清和含药血清对细胞生长的影响，根据检测结果确定，各组均选择对细胞生长和细胞形态影响较小的10%(体积分数，以下同)的血清浓度为工作浓度。六味地黄丸含药血清再分为低剂量(2?5%的含药血清+7?5%的对照血清)、中剂量(5%的含药血清+5%的对照血清)、高剂量(10%含药血清)。

1?5Western blot技术检测

B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平实验分为无鼠血清的空白组，对照血清组，中、高剂量含药血清组共4组。将细胞培养于25cm3的培养瓶中，长至90%融合时，加入200μL细胞裂解液，细胞刮匙刮下细胞，在冰上裂解30min。裂解液于4°C下12000r/min离心10min;取上清得总蛋白提取液，测定各组蛋白浓度。取样加入1/4体积的5倍十二烷基磺酸钠(SDS)蛋白加样缓冲液，煮沸10min，进行SDS?PAGE分离蛋白，电泳后蛋白转移至硝酸纤维素膜上，丽春红染色验证蛋白转移成功。以50g/L 的脱脂奶粉封闭2h后，依次加入Cx26/30/32一抗，室温孵育2h，Tris?HCl缓冲盐溶液(TBS)/T(在TBS溶液中加入体积分数0?05%吐温20)洗2次，0?01mol/LTris 缓冲液(含8g/LNaCl、3g/LTris，pH8?0)洗1次，HRP标记二抗室温孵育 2h，TBS/T洗2次，TBS洗1次，加入HRP?ECL发光液，最后用X胶片进行曝光显影。

1?6间接免疫荧光法检测