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关于补骨脂素对乳腺癌MCF?7和MDA?MB?231细胞体外作用的比较研究

作者：谭敏，孙静，赵虹，何青莲，胡少为，李楚天

【摘要】 【目的】观察并比较补骨脂素对人乳腺癌MCF?7和MDA?MB?231细胞的抑制作用。【方法】以不同浓度的补骨脂素(25?000、12?500、6?250、3?125 μg/mL)对人乳腺癌细胞株MCF?7[雌激素受体(ER)阳性]和MDA?MB?231(ER阴性)进行体外抑制实验，运用流式细胞仪观察细胞的周期变化,Annexin V和碘化丙锭(PI)双染法观察细胞凋亡情况,基因芯片检测补骨脂素对两种人乳腺癌细胞基因表达谱的影响。【结果】补骨脂素对人乳腺癌细胞株MCF?7有显著抑制作用(P<0?05)，半数抑制浓度(IC50)为15?160 μg/mL;作用24 h后，S期细胞明显减少，G1、G2期细胞增加，早期凋亡细胞明显增多。而补骨脂素对MDA?MB?231细胞无明显抑制作用，仅早期凋亡细胞增多。人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片杂交结果显示，补骨脂素可以使MCF?7细胞出现1 053个差异表达基因，其中表达上调的有456个，表达下调的有657个。【结论】补骨脂素对ER阳性的乳腺癌MCF?7细胞具有一定的抑制作用，其抑制肿瘤细胞生长的机理可能与将肿瘤细胞阻止在G2期相关。

【关键词】 补骨脂素/药理学;乳腺肿瘤/中药疗法;细胞凋亡;基因表达调控;细胞培养

补骨脂素是从中草药补骨脂中分离提取的有效成分。研究表明补骨脂素对人乳腺癌、胃癌、宫颈癌、舌癌、黏液表皮样癌及白血病等细胞株均有体外生长抑制及细胞毒作用[1]，但其作用机理尚需进一步研究。本研究拟用补骨脂素对雌激素受体(ER)阳性人乳腺癌细胞株MCF?7、ER阴性人乳腺癌细胞株MDA?MB?231进行体外抑制实验，同时运用流式细胞仪检测癌细胞的增殖及早期凋亡情况，并检测用药前后基因表达谱的变化，将两种细胞株对补骨脂素的反应进行比较，观察补骨脂素是否对各种类型乳腺癌细胞均有抑制作用，进一步阐明补骨脂素对乳腺癌细胞的抑制机理。现将结果报道如下。

1材料和方法

1?1材料人乳腺癌MCF?7细胞株、MDA?MB?231细胞株均由南方医科大学引进;补骨脂素购于中国生物制品研究所;流式细胞仪早期凋亡检测试剂盒Annexin V/碘化丙锭(PI) apoptosis Kit 为美国Caltac 公司产品;细胞周期检测用PI为美国Beckman Cuiter公司产品;噻唑蓝(MTT)试剂为Sigma公司产品;晶芯?22K人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V1?0，共有21 522条70 mer(monomerie unit，单体单元)长度的OligoDNA，为博奥生物公司产品;Lux Scan 3?0图像分析软件为CapitalBio公司产品;其他基因芯片检测仪器及分析系统均为博奥生物公司产品。

1?2MTT法测定补骨脂素对两种乳腺癌细胞株生长的影响分别取MDA?MB?231及MCF?7两种细胞株对数生长期细胞0?5×105分别接种于96孔培养板，100 μL/孔，培养过夜后，分别加入25?000、12?500、6?250、3?125 μg/mL补骨脂素，培养24 h，加MTT后在酶标仪上以570 nm波长检测D值，每组检测8孔。按公式计算抑制率：p抑制=(1-D实验组/D对照组)×100% 。以半数抑制浓度(IC50)计算软件计算IC50。

1?3流式细胞仪检测细胞周期改变将培养的两种细胞株按上述4个浓度加入补骨脂素，设空白对照组，培养24 h后收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞1～2次，1 500 r/min离心,弃上清，加体积分数75%乙醇1 mL固定，-20℃过夜后，PBS洗细胞1~2次，加500 μg PI 染液，4℃孵育30 min，上流式细胞仪检测。

1?4流式细胞仪检测细胞早期凋亡分别收集4个浓度及空白对照组细胞，用PBS洗细胞1~2次，1 500 r/min离心，弃上清，将细胞悬于Binding Buffer中，加5 μL Annexin V和10 μL PI，室温避光孵育5 min，上流式细胞仪检测。

1?5基因表达谱芯片检测差异表达基因Trizol一步法分别提取两种细胞株给药组(补骨脂素浓度为12?5 μg/mL)及空白对照组细胞中的总RNA，按说明书方法进行。两种细胞株分别以Cy5?脱氧胞苷三磷酸(Cy5?dCTP)标记补骨脂素作用组，Cy3?dCTP标记空白对照组为第1对样本;荧光交换，以Cy3?dCTP标记补骨脂素作用组，Cy5?dCTP标记空白对照组为第2对样本。两对样本分别在两张22K晶芯?人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片上，42℃杂交过夜。杂交后清洗甩干用于扫描。芯片使用LuxScan10KA双通道激光扫描仪进行扫描，获取每个阵列、每种染料(Cy3和Cy5)的扫描图像。使用基因芯片数据提取软件从扫描图像中提取数据。进一步分析得出Cy3、Cy5的荧光数字信号值及Cy3∶Cy5比值(ICy3∶ICy5)，并分别计算出荧光交换2次重复试验的平均值，选出差异表达的基因并分析。