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部分地面水体细菌耐药性分析

作者：刁汇玲 高金祥 蒋淑君

【摘要】 目的 为了了解滨州市内地面水体中细菌的耐药性，并探讨其与耐药质粒谱之间的关系。方法 采集滨州市内4个地面水体的水样，分别检测水样菌落形成单位(colony?forming unit，CFU)以及氨苄青霉素耐药率，用K?B法对氨苄青霉素耐药菌株分别做7种不同抗生素的药敏试验，然后提取这些菌株的质粒，用EcorI酶切质粒电泳后分析酶切质粒谱。结果 样本氨苄青霉素耐药率达11?7%~49?8%。氨苄青霉素耐药菌株对其他3种不同的抗生素分别有12?5%~25%不等的耐药性，未找到耐西拉司丁钠的菌株。耐氨苄青霉素以及一种非β内酰胺类抗生素的菌株占32?5%，耐氨苄青霉素以及两种或者以上的非β内酰胺类抗生素的菌株占20%。酶切质粒谱共找到从815 bp~12?2 kb的63种大小不等的酶切片断。结论 滨州市地面水体中细菌耐药性普遍存在，且多重耐药性明显;对细菌耐药性的监测是十分有意义而且有必要的。

【关键词】 地面水体;细菌耐药性;质粒谱

【Abstract】 Objective To survey the condition of antibiotic resistance in ground water body of Binzhou, and to study its relationship with plasmid profiles.Methods Water samples were collected from 4 places of ground water body of Binzhou, then CFU was counted and the antibiotic resistance rate was analyzed. K?B method was used to practice the susceptibility test with 5 antibiotics, then the antibiotic resistance spectrums were analyzed.Results The ampicillin resistance rate of the samples varies from 11?7% to 49?8%. The ampicillin resistant isolates have different antibiotic resistance rate which varies from 12?5% to 25% relevant to 3 other antibiotics，and the cilastain resistance was not found . Isolates with the trait of ampicillin resistance and one non?β?lactam antibiotic reached 32?5%, and isolates with the trait of resistant to ampcillin and two or more non?β?lactam antibiotics reached 20%. There are 63 plasmids bands which varys from 815bp to 12?2kb in plasmid profiles.Conclusion The antibiotic resistance in ground water body of Binzhou was prevalent, and the phenomenon of multidrug resistance is obvious too. It is significant and necessary to monitor the antibiotic resistance status .

【Key words】 ground water body, drug resistance of bacteria, multidrug resistance

在自然界中，细菌的耐药性是普遍存在的。随着现代医学中抗生素的大量使用，在自然选择压力下，细菌的耐药性也越来越强，再加上耐药基因的传代、转移、扩散，耐药菌越来越多，耐药程度不断增加，形成高度和多重耐药。大量研究表明质粒的水平转移在细菌多重耐药性的形成中起了重要作用[1]。通过这种水平转移，细菌的耐药性扩散迅速、广泛，耐药株可自身克隆扩散，也可与敏感株进行遗传物质交换。这种现象在自然水体中广泛地存在，这使多重耐药性成为一个世界范围内的问题，造成和加剧了对新的抗菌药物的需求。本课题的研究目的就是要了解滨州市部分地面水体中细菌耐药性的特点，并分析该地区细菌耐药性与细菌质粒谱的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 常规Luria?Bertani(LB)培养基。Mueller Hinton(MH)琼脂培养基、药敏纸片、0.5麦氏比浊管等购自杭州天和微生物试剂有限公司。质控菌株大肠杆菌ATCC25922由浙江大学附属第一医院检验科细菌室提供。

1.2 主要仪器 普通超净工作台，柯达电子成像和分析系统120(柯达公司)，Gel?pro Analyzer 4?0(Media Cybernetic公司)。

1.3 方法

1.3.1 采集水样：用灭菌的吸量管采集水样。每个水体中采5个水样，每个水样采集点之间的距离超过100 m，每个水样采集10 ml，并记录水温。

1.3.2 检测水样菌落形成单位(CFU)以及氨苄青霉素耐药率： 稀释水样至1∶10和1∶100,将稀释的水样分别培养到LB琼脂和氨苄青霉素(终浓度60 μg/ml)+LB琼脂培养基中(每个培养皿中0?1 ml的稀释后水样)，然后在37 ℃的恒温箱中培养24 h。培养后分别计数每个培养皿中的菌落数目(采用柯达电子成像和分析系统120摄像后用Gel?pro Analyzer 4?0自动计数)。

1.3.3 K?B法药敏实验：将耐氨苄青霉素组的菌株进行纯培养(37 ℃，氨苄青霉素+LB琼脂培养基中24 h)，之后从每个培养皿中挑取两个远离的菌落各自放入盛有3 ml 氨苄青霉素+MH肉汤的试管中，在37 ℃的摇床中摇约3 h。从每个试管中取1 ml菌液，用生理盐水稀释至0?5 MacFarland标准浊度;另外的2 ml菌液继续在37 ℃摇床中培养过夜。用棉签将稀释的菌液涂布在MH琼脂培养基上，美国NCCLS药敏实验纸片扩散法[2]对每个菌株进行药敏实验。实验采用的抗生素有氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、左氧氟沙星、西拉司丁钠。

1.3.4 酶切质粒谱分析：将过夜培养的菌株用碱裂法制备少量质粒DNA[3]，将质粒用EcorI酶切后在0.7%凝胶琼脂糖平板上加样电泳[4]，以1 kb Gene Ladder作为标准，10 V/cm稳压电泳1 h，在柯达凝胶成像系统中摄影后，获取照片后使用Gel?pro Analyzer 4?0 分析。

2 结果

2.1 水样CFU以及氨苄青霉素耐药率 从4个水体中采集到的20个水样中细菌CFU和氨苄青霉素耐药率见表1，从表中我们可以看到4个水体中的细菌CFU已经较高，而且细菌对氨苄青霉素的耐药率也相当高。

表1 水体中细菌CFU和氨苄青霉素耐药率水体nalogCFU/mlb氨苄青霉素耐药率(略)

2.2 药敏试验 通过纸片法药敏实验得到的氨苄青霉素耐药菌株对其它抗生素的耐药谱见表2。从表2中我们看到不同细菌对多种抗生素具有耐药性，而未发现作为碳青霉烯类的西拉司丁钠有耐药菌株。

表2 氨苄青霉素耐药菌株对其它抗生素的耐药性水体测试　略