在应用冻存后的去T细胞脐血作造血重建方面,重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及促红细胞生成素(EPO)为日本麒麟啤酒株式会社产品。

目前的研究表明,非血缘关系的脐血移植(umbilical cordblood transplantation, CBT)也是重要的造血干细胞来源[1]。而脐血库的建立为开展配型不合的CBT提供了保证。但是,CBT可能发生移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD),尤其是配型不合的CBT,从而影响移植成功率。免疫毒素(immunotoxin,IT)能有效去除脐血T细胞而对造血祖细胞无明显影响[2],为预防重度GVHD提供了有效手段。我们观察了IT去除脐血T细胞后的冻存效果。报告如下。脐血收集无菌条件下在医院里正常分娩的健康产妇,在其胎盘未脱离母体前在脐带断端留取脐血标本10份,加肝素25 U/ml抗凝,置4℃冰箱存放不超过24 h。主要试剂及材料

IT为军事医学科学院基础医学研究所赠送,重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及促红细胞生成素(EPO)为日本麒麟啤酒株式会社产品。

实验方法

1.脐血单个核细胞(mononuclear cell,MNC)的分离:取7~10 ml脐血,用4倍生理盐水进行稀释,将标本缓慢加入含淋巴细胞分离液的离心管中,2 500 r/min,离心20 min。吸出界面单个核细胞,用生理盐水洗2遍,制成所需浓度的细胞悬液。

2.IT处理脐血的方法[2]:将脐血标本分成2份,一份为全血,另一份为MNC。将脐血MNC调为1×106/ml~1×107/ml,悬浮于10%胎牛血清(fetus calf serum, FCS)-1640-100mmol/L半乳糖体系中,使抗CD5T细胞免疫毒素(CD5ricin,10-10mmol/L)分别作用于上述细胞悬液,在37℃、5%CO2饱和湿度的条件下孵育2 h,以1 640液洗2遍。并分别制成所需浓度的细胞悬液。按下述“5”的方法冻存。

3.锥虫蓝染色法测定细胞活力

4.造血细胞的培养:脐血MNC及全血的造血祖细胞培养:粒-单系集落形成单位(colony forming unit-granulocyte andmacrophage CFU-GM);红系集落形成单位(burst forming unit-erythroid,BFU-E)按参考文献[3]的方法进行培养。即rhGM-CSF 50 ng/ml,EPO为2 U/105,有核细胞数为2×105/L。全血作细胞培养时,集落计数前滴入3%醋酸,可使集落清晰突出。多向祖细胞或混合集落形成单位(multipotentialhemopoietic progenitors CFU-Mix)细胞培养:按参考文献[4]的方法进行。

以未经IT处理的新鲜脐血为对照组,其造血祖细胞增殖率为100%。各实验组,包括经IT处理的各实验组(脐血单个核细胞组及全血组),各组分别冻存1个月和6个月,其中冻存6个月的脐血MNC复温后再与细胞因子孵育。各实验组的造血祖细胞增殖率按如下公式计算:造血祖细胞增殖率(%)=实验组平均集落数对照组平均集落数×100%

5.脐血单个核细胞及全血冷冻保存:在冰水浴中,向含有脐血MNC或全血的聚丙稀冷冻管中加入等体积冷冻保存液。联合低温保护剂由羟乙基淀粉(HES)、AB型血清、二甲基亚砜(DMSO)和1640液组成。四者比例为12∶10∶10∶68。细胞最终浓度为5×106/ml,脐血直接放入-70℃冰箱中,12h后放入液氮中保存[5]。