6.脐血的复温: (1)冷冻管分别于保存1、6个月后取出复温。复温的方法为:冷冻管从液氮中取出后即放入37℃水浴中反复摇动,使其快速复温。按冷冻前的细胞浓度计算,稀释至一定浓度后进行造血祖细胞培养,培养完毕后进行有核活细胞计数。(2)冻存后细胞孵育:复苏后的细胞在4℃、1 640液逐步稀释,不洗细胞。脐血单个核细胞悬液加rhGM-CSF作为实验组,对照组以DMEM补充体积,在37℃、5%CO2饱和湿度下孵育2 h,洗涤,分别按上述方法测定3种造血祖细胞产率。每次实验测试1个标本,实验在相同的条件下进行。

统计学处理:统计学比较:成组t检验,实验数据以平均数±标准差表示。

结果

1.冻存时间对去T细胞脐血造血祖细胞的影响:在本实验条件下,脐血MNC悬液在液氮中保存1、6个月后其MNC活力,脐血各系造血祖细胞的回收率见表1。结果表明,各冻存组MNC活力及各系祖细胞增殖率均分别少于未冻存组,差异有显著性;清除T细胞后冻存组与未清除T的脐血冻存组相比MNC活力及各系祖细胞增殖率差异均无显著性。

2.脐血造血祖细胞冷冻损伤可复性的研究:以冻存6个月的去T细胞脐血进行冷冻损伤可复性观察,实验组经过与GM-CSF(40 ng/ml)在5% CO2、37℃孵育2 h后,离心洗涤2次,与未经孵育的冻存脐血造血祖细胞的增殖率相比,实验组的增殖率增加,差异有显著性(表1)。此外,观察了脐血全血冻存效果,结果与脐血MNC类似。

讨论

已知GVHD的发生与移植物中T细胞有密切关系,去除T细胞是预防GVHD的有效方法。脐血中含有一定比例的T细胞。我们证实IT能安全有效去除脐血T细胞而对造血祖细胞无明显影响[2],并且脐血的长期冻存效果已得到证实[6]。但是免疫毒素去除脐血T细胞后的冻存效果尚未研究。本研究观察免疫毒素去除脐血T细胞后各系造血祖细胞的恢复率,发现液氮保存半年左右,各系祖细胞恢复率为55%以上(与免疫毒素处理后未冻存组相比,恢复率为60%左右)。保存6个月左右恢复率与1个月无明显差异,说明免疫毒素去除脐血T细胞后冻存的可行性,为进一步开展配型不合CBT提供了有利条件。由于单份脐血有核细胞数有限,在去除脐血红细胞过程中可能裹夹一些有核细胞,而引起不同程度脐血有核细胞数的丢失。我们观察到,脐血全血经免疫毒素去除T细胞后冻存,与去T细胞后的脐血MNC冻存效果相比,无明显差异。提示可用全血冻存,能减少脐血移植有核细胞数的损失,满足移植的需要。

已知冷冻过程对造血祖细胞有一定的损伤作用,主要来自细胞内外结冰、电解质浓缩变化和细胞体积的改变。电镜下表现为染色质的凝聚、线粒体肿胀、核糖核蛋白体的减少等,反映了造血祖细胞活力的降低。一些实验表明,造血祖细胞在一定条件下可能恢复增殖的能力[7]。而GM-CSF是一种多种造血祖细胞的刺激因子,在刺激细胞增殖的同时也促进受伤细胞能量的合成,促进细胞内外水、电解质平衡而恢复其活力。我们观察到经细胞因子孵育的冻存去T细胞脐血其造血祖细胞增殖有一定的恢复性。因此,可考虑在脐血冷冻复温后,与一定的细胞因子孵育,能减少冻存过程对造血祖细胞的损伤,对应用冻存后的去T细胞脐血作造血重建有一定意义。

上述提供了应用冻存后的去T细胞脐血作造血重建的相关内容。

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