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作者：沙焕臣，拉吉姆，马清涌，徐复国，马振华

【摘要】 目的： 探讨白藜芦醇(RES)对实验性重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺损伤的保护作用及其机制. 方法： 32只成年雄性SD大鼠随机分为假手术(SO)组;SAP组;地塞米松(DEX)组和RES治疗组. 各组大鼠在制模后12 h采集标本. 动脉血气分析检测动脉血氧分压(PaO2);酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清TNF?α和IL?6含量;透射电镜(TEM)观察肺脏超微结构变化;RT?PCR检测凋亡调控基因Bax, Bcl?2和Caspase?3 mRNA表达;Western Blot检测凋亡调控蛋白Bax，Bcl?2，Caspase?3和线粒体内细胞色素c(Cyt c)表达. 结果： SO组，SAP组，RES组和DEX组PaO2水平分别为：(108.30±8.24)，(76.34±5.18)，(97.43±6.02)，(92.50±5.97) mmHg，RES组和DEX组PaO2水平明显高于SAP组(P<0.05). TNF?α含量分别为：(12.54±0.75)，(95.59±5.61)，(61.66±3.33)，(50.90±4.62) ng/L，RES组与SAP组相比较，差异有统计学意义(P<0.05). IL?6含量分别为：(9.29±1.75)，(55.68±7.24)，(32.29±3.98)，(42.51±3.3) ng/L，RES组与SAP组相比较，IL?6含量明显降低(P<0.05). HE和TEM镜下观察结果显示，SAP组肺组织明显充血肿胀，并可见大量炎细胞浸润和细胞凋亡，线粒体肿胀明显;RES组肺组织病理损害程度较SAP组减轻;PCR结果显示，SAP组凋亡调控基因Bax, Caspase?3 mRNA表达较SO组明显升高，Bcl?2 mRNA表达降低，RES组Bcl?2 mRNA表达较SAP组升高(P<0.05)，Bax, Caspase?3 mRNA表达较SO组明显降低，Western Blot 检测结果与PCR结果一致. 结论： RES可以通过线粒体途径抑制SAP大鼠肺组织细胞凋亡，从而起到改善肺脏损伤的作用.

【关键词】 急性胰腺炎;白藜芦醇;肺损伤

0引言

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)患者常见的早期并发症和主要死亡原因之一[1-2]. 目前对于SAP并发ALI的机制研究主要集中在炎症因子、细胞介质和微循环障碍等方面，认识ALI的发病机制以及如何采取有效措施进行预防和治疗，已成为各国学者竞相研究的热点问题. 有研究[3-4]显示，白藜芦醇(resveratrol, RES)具有治疗大鼠SAP肺损伤的作用. 但是有关RES缓解肺损伤作用机制的研究还少见报道. 本研究在成功建立大鼠SAP模型后，从调控细胞凋亡的线粒体通路入手，观察RES对大鼠肺脏损伤的保护作用以及其作用通路，探讨RES缓解SAP肺损伤的作用机制.

1材料和方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠32只，体质量250~300 g(西安交通大学动物中心提供);牛磺胆酸钠(美国Sigma公司);RES(西安奥塞斯生物有限公司);TNF?α，IL?6 ELISA检测试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司);PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司);引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;凋亡调控蛋白Bax，Bcl?2，Caspase?3，细胞色素c(Cytochrome c,Cyt c) mAb(美国Santa Cruz生物技术有限公司);辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ⅱ抗、小鼠抗β?actin mAb(北京博奥森生物技术有限公司);线粒体提取试剂盒(上海杰美生基因医药科技有限公司);增强化学发光剂 (美国Pierce生物技术有限公司);透射电镜(日本东芝公司).

1.2方法

1.2.1动物分组及SAP模型建立将32只大鼠随机分为假手术(SO)组、SAP组、RES治疗组和地塞米松(dexamethasone, DEX)组，每组动物8只. 大鼠禁食12 h，禁水4 h，25 g/L戊巴比妥钠(1.2 mg/kg)腹腔注射麻醉. 动脉夹夹闭胰胆管近端和远端，40 g/L牛磺胆酸钠(1 mL/kg)经胰胆管逆行注射建立SAP模型，注射时间保持1 min，拔出穿刺针，取出动脉夹. SO组仅于开腹翻动十二指肠后缝合腹壁，胰胆管内不注射任何药物;在建立SAP模型后，经阴茎背静脉RES组立即注射RES 10 mg/kg;DEX组立即注射DEX 0.5 mg/kg. 大鼠在制模后12 h剖杀取材.

1.2.2大鼠腹水计量和死亡率记录在取材前先打开大鼠腹壁，以10 mL无菌注射器收集大鼠腹水并计量. 大鼠死亡率计算方法为未到12 h死亡的大鼠从本组中排除，另选大鼠补齐，以死亡的大鼠数量和总计应用的大鼠数量比值计算大鼠死亡率.

1.2.3动脉血PaO2检测在大鼠剖杀前从腹主动脉取血0.5 mL,应用i?STAT全自动血气分析仪检测各组大鼠动脉血气分析.

1.2.4血浆TNF?α和IL?6 ELISA检测应用ELISA检测试剂盒检测大鼠血浆中TNF?α和IL?6含量，详细步骤严格按照试剂盒说明书进行操作.

1.2.5肺组织和胰腺组织的病理学观察肺组织和胰腺组织40 g/L多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察胰腺组织病理学改变. 另取肺脏和胰腺组织1 mm×1 mm×1 mm以25 g/L戊二醛4℃固定8 h，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon812浸透，LKB?V型超薄切片机进行超薄切片(50~70 nm)，电镜下观察肺和胰腺组织超微结构改变.

1.2.6肺组织总RNA提取及RT?PCR用Trizol试剂提取肺组织中的总RNA，测定260 nm/280 nm的A值，计算RNA浓度. 取RNA 2 μL，用RT试剂盒合成cDNA链. 再以逆转录反应液2 μL作为模板，PC